RhoファミリーG蛋白群の時空間的制御機構の解析

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16390078
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 松田 道行 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (10199812)
• 研究分担者: 黒川 量雄 (独)理化学研究所, 中野生体膜研究室, 研究員 (40333504)
• キーワード: Rho / FRETプローブ / 上皮細胞増殖因子

研究概要

上皮細胞増殖因子によるRhoファミリーG蛋白の活性制御機構を引き続き研究した。上皮細胞増殖因子により活性化されRhoファミリーG蛋白の活性化を誘導するグアニンヌクレオチド交換因子を同定するために、RNAiにて遺伝子をノックダウンし、その細胞にFRETプローブを発現させて、上皮細胞増殖因子依存性のRhoファミリーG蛋白活性化因子を同定するという実験を行った。まず、RNAiのノックダウン効率が高く、かつ上皮細胞増殖因子依存性のRhoファミリーG蛋白の活性変化が見やすい細胞をスクリーニングした。その結果、A431細胞がもっとも適していることがわかったので、この細胞をさらにサブクローニングして、安定した実験系を確立した。この細胞において、現在までに6種類のG蛋白活性化因子をRNAiでノックダウンし、上皮細胞増殖因子依存性RhoファミリーG蛋白の活性変化を観察した。すでに、このうちの一つにおいて、上皮細胞増殖因子依存性のRho不活化およびRac活性化が阻害されるという結果を得ている。そこで、この分子が上皮細胞増殖因子の刺激によりどのような変化を受けるか解析したところ、上皮細胞増殖因子依存性にチロシンリン酸化されることがわかった。そこで、現在、このチロシンリン酸化部位に対する抗体を作成し、その意義について解析中である。また、このグアニンヌクレオチド交換因子が上皮細胞増殖因子依存性にどのような構造変化を受けるか、そしてチロシンリン酸化は構造にどのような影響を与えるかを解析するために、この分子の構造変化を解析するためのFRETプローブを作成した。最終年度にこれらの結果をまとめて、上皮細胞増殖因子依存性にRhoファミリーG蛋白の活性が制御されるメカニズムを発表する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 97 ページ: 8-15
• [雑誌論文] Dynamics of the RAS/ERK map kinase cascade as monitored by fluorescence probes. (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujioka, A., terai, K., Itoh, R.E., Aoki, K., Nakamura, T., Kuroda, S., Nishida, E., Matsuda, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. (In press)
• [雑誌論文] Interleukin-1 receptor-associated kinase-1 plays an essential role for Toll-like receptor (TLR)7- and TLR9-mediated interferon-{alpha} induction. (2005)
  • 著者名/発表者名: Uematsu, S., Sato, S., Yamamoto, M., Hirotani, T., Kato, H., Takeshita, F., Matsuda, M., Coban, C., Ishii, K.J., Kawai, T., Takeuchi, O., Akira, S.
  • 雑誌名: J.Exp.Med. 201 ページ: 915-923
• [雑誌論文] FRET imaging in nerve growth cones reveals a high level of RhoA activity within the peripheral domain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Mol.Brain Res. 139 ページ: 277-287
• [雑誌論文] Monitoring spatio-temporal regulation of Ras and Rho GTPase with GFP-based FRET probes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Methods 37 ページ: 146-153
• [雑誌論文] Localized RhoA Activation as a Requirement for the Induction of Membrane Ruffling. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Mol.Biol.Cell 16 ページ: 4294-4303
• [雑誌論文] Mechanism and role of localized activation of Rho-family GTPases in growth factor-stimulated fibroblasts and neuronal cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa, K., Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Biochem.Soc.Trans. 33 ページ: 631-634
• [雑誌論文] Involvement of the c-Src-Crk-C3G-Rap1 signaling in the nectin-induced activation of Cdc42 and formation of adherens junctions. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukuyama, T., Ogita, H., Kawakatsu, T., Fukuhara, T., Yamada, T., Sato, T., Shimizu, K., Nakamura, T., Matsuda, M., Takai, Y.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 815-825
• [雑誌論文] Ras binding opens c-Raf to expose the docking site for MEK. (2005)
  • 著者名/発表者名: Terai, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: EMBO Rep. 6 ページ: 251-255
• [雑誌論文] A FRET-based probe for epidermal growth factor receptor bound non-covalently to a pair of synthetic amphipathic helixes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Itoh, R.E., Kurokawa, K., Fujioka, A., Sharma, A., Mayer, B.J., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Experimental Cell Research 307 ページ: 142-152
• [雑誌論文] Local PIP3 accumulation recruits Vav2 and Vav3 to activate Rac1/Cdc42 and initiate neurite outgrowth in nerve growth factor-stimulated PC12 cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Aoki, K., Nakamura, T., Fujikawa, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Mol.Biol.Cell 16 ページ: 2207-2217