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マラリア原虫の赤血球侵入型であるメロゾイトの先端部小器官の一つロプトリーに局在するRhopH複合体は、その遺伝子座を破壊した原虫は作製できないことから、原虫の生存に必須の蛋白質であると考えられている。我々は、これまでにRhopH複合体が赤血球への結合能を有することを明らかにしたが、その分子機構の解明は進んでいない。そこで、熱帯熱マラリア原虫のRhopH複合体の赤血球結合ドメインの同定をおこなうため、本年度ではまず、部分的なRhopH複合体の組換え蛋白質を発現させた熱帯熱マラリア原虫を遺伝子導入により作成することを目標とした。
まず、発現したい蛋白質をロプトリー蛋白のプロモーターにより緑色蛍光蛋白質との融合蛋白として発現する基本エントリー・コンストラクトを構築し、熱帯熱マラリア原虫の遺伝子導入ベクターをゲートウェイ・テクノロジー(Invitrogen社)が利用できるように再構築した。つぎに、RhopH複合体を構成する蛋白質のうち、RhopH1を3つの部位に分け、N末端の1/3、N末端の2/3、全長を発現する3つのコンストラクトを作成した。発現部分の塩基配列が正しいことを確認した後、熱帯熱マラリア原虫に発現コンストラクトを遺伝子導入した。最初に、導入プラスミドを効率的に維持する効果があると考えられていた熱帯熱マラリア原虫rep20配列を加えたコンストラクト4種類を遺伝子導入したマラリア原虫を作成したが、GFPの発現は確認できなかった。rep20により転写抑制がおきた可能性を考慮し、rep20を除去したコンストラクトを用いて遺伝子導入をやり直したところ、基本コンストラクトについては、GFPの発現が、ロプトリー蛋白プロモーターで予想される時期に特異的に見られた。現在、他のコンストラクトについて、薬剤選択圧下で培養をおこなっている。
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