| 研究課題/領域番号 |
16390212
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
中里 雅光 宮崎大学, 医学部, 教授 (10180267)
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| 研究分担者 |
山口 秀樹 宮崎大学, 医学部, 助手 (10305097)
村上 昇 宮崎大学, 農学部, 教授 (80150192)
寒川 賢治 国立循環器病センター, 研究所, 副所長 (00112417)
伊達 紫 宮崎大学, 医学部, 特任助教授 (70381100)
十枝内 厚次 宮崎大学, 医学部, 特任助手 (80381101)
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| キーワード | 摂食・エネルギー代謝調節 / ペプチドの網羅的解析 / オーファン受容体 / Ca^<2+>イメージング装置 / 腫瘍細胞株 / 高感度RIA系 |
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| 研究概要 |
培養細胞からのペプチドーム・ペプチドミクスを活用したペプチドの網羅的解析を行えば、前駆体蛋白由来のペプチドフラグメントが多数同定でき、その前駆体蛋白の遺伝情報や新たに同定したペプチドフラグメントのアミノ酸配列から生理活性を有するペプチドが推定可能であると考えられた。実際にこの方法を消化管由来培養細胞株に適用した結果、約250個のペプチドフラグメントが整然と同定された。その中から重要と推定されるペプチドを合成し、標的細胞の生物活性を評価した。腫瘍細胞株、オーファン受容体発現系の細胞株やラット消化管から分離・培養した初代細胞、および96サンプルを一度に測定できる現有の最新Ca^<2+>イメージング装置(IMACS細胞内イオン動態画像解析システム)を用いて解析した結果、細胞内カルシウム上昇活性を有する2つの生理活性ペプチドを同定した。同定したペプチドのアミノ酸配列に基づき、ラット組織よりペプチドをコードするcDNA配列を決定し、ペプチド前駆体構造を明らかにした。その結果、摂食・エネルギー代謝調節に関与する既知遺伝子のペプチド断片であることを見いだした。消化管各部位のmRNA発現量について定量PCRを行い、消化管全体に発現し、絶食で変動することを認めた。家兎に免疫して新規ペプチド特異的抗体を作製し、高感度RIA系を開発した。この定量系を用いて、新規生理活性ペプチドの消化管内ペプチド濃度を検討した結果、胃から大腸にかけて免疫活性を認め、消化管下部に行くに従いその組織含量が増加することを見いだした。消化管での局在を検討した結果、消化管粘膜固有層およびにマイスナー神経叢、アウエルバッハ神経叢に強い免疫活性を認め、消化管運動に関与することが示唆された。本申請での網羅的ペプチド解析で生理活性を有する新規ペプチドが同定されることが証明された。
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