| 研究課題/領域番号 |
16390293
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
大津 真 筑波大学, 大学院・人間総合科学研究科, 講師 (30361330)
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| 研究分担者 |
有賀 正 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (60322806)
宮本 正樹 北海道大学, 北海道大学病院, 助手 (40333611)
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| キーワード | CXCR4 / 血液幹細胞 / 骨髄移植 / レトロウイルベクター / WHIM |
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| 研究概要 |
1.野生型(Wt)およびWHIM変異導入(WHIM型)Cxcr4発現レトロウイルスベクターおよびウイルス上清の作製
レトロウイルスベクターpGCDNsam-IRES-EGFP(筑波大小野寺先生)にマウスCxcr4 cDNA(京大長澤先生、大阪母子保健総合医療センター杉山先生)を挿入しwt-Cxcr4発現ベクターを作製した。WHIM患者でみられる変異をマウスcDNAに導入し、Cxcr4のWHIM変異体を作製した。R334X変異(マウスではR341X)、E343X変異(同、E350X)はそれぞれ19および10アミノ酸のC末欠失体であり、それぞれWHIM-1,WHIM-2変異体と命名した。PCR法により、上記ベクターにWHIM型変異を導入し、変異体発現ベクターを作製した。293GPG細胞を用いてウイルス産生細胞株を樹立し、高タイターのウイルス上清を調製した。
2.wt-およびWHIM型Cxcr4の機能性評価
CXCR4非発現細胞株K562に遺伝子導入し、wtおよびWHIM型Cxcr4の発現を確認した。WHIM変異体ではSDF1刺激によるinternalizationが野生型に比較して著しく低下していた。
3.マウス骨髄幹/前駆細胞(HSPC)への遺伝子導入およびWHIM型Cxcr4の機能性評価
C57BL6マウスHSPCに高効率(〜80%)に遺伝子導入が可能となり、導入遺伝子由来Cxcr4の発現を確認した。トランスウェルを用いたin vitro migration assayにおいてWHIM変異体発現細胞のSDF1濃度勾配への反応性の増強を認めた。
4.マウス骨髄移植におけるWHIM変異体発現細胞の生着促進
移植後短時間(〜20h)での脾臓および骨髄へのhomingを比較する信頼性の高い方法を確立した。5月までに生着促進効果におけるWHIM変異体のwt-Cxcr4に対する優位性をこの方怯を用いて検証する。
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