| 研究課題/領域番号 |
16390532
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能系基礎歯科学
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (70217149)
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| 研究分担者 |
東城 庸介 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (90111731)
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (00305913)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2007
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| キーワード | イノシトール1,4,5三リン酸 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 蛍光プローブ / 蛍光タンパク質 / 細胞内カルシウム / スクリーニング / イメージング / イノシトール1,4,5三リン酸受容体 |
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| 研究概要 |
本研究では、我々が開発したイノシトール1,4,5三リン酸(IP_3)分子センサーLIBRAを改良し、細胞内IP_3動態の解明や創薬研究への応用を目指した。
LIBRAの利用にあたり、pHによる蛍光の変化が問題になっていた。そこでEYFPをpH安定なVenusに置換した結果、pHによる蛍光比の変化が約1/5に抑えられた。またLIBRAのIP_3結合ドメインの置換とアミノ酸変異によってIP_3に対する親和性を約5倍に高めることができた。さらに、IP_3による蛍光変化から細胞内IP_3濃度に換算する方法を確立した。
このpH安定で高感度な改良型IP_3分子センサーを使って、Ca^<2+>オシレーションに伴うIP_3動態を解析した。COS-7細胞では1-3uMのATP刺激によってCa^<2+>オシレーションが観察されたが、IP_3オシレーションは認められなかった。一方、HSY細胞では、Ca^<2+>オシレーションと同調したIP_3スパイクが観察された。IP_3スパイクの大きさは10〜100nMで、IP_3濃度が完全に低下する前に次のスパイクが起こることがわかった。HSY細胞のCa^<2+>オシレーションは、IP_3スパイクの消失後も持続することや、Ca^<2+>オシレーションのピークがIP_3スパイクのピークに先行することから、IP_3スパイクはCa^<2+>オシレーションに必須では無いことが示唆された。
LIBRAを創薬研究に利用するために、LIBRAとそのIP_3非感受性変異体を利用して、IP_3受容体リガンドの検索を行う方法を確立し、コンピュータ・シュミレーションに基づいて合成された化合物の中から、実際にIP_3受容体リガンドとして作用する化合物を見いだした。さらに、タイプI、II、III IP_3受容体を用いたLIBRAシリーズを利用しアデノホスチン誘導体のサブタイプ特異性を明らかにし、タイプIII IP_3受容体の部分アゴニストを見いだした。
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