| 研究概要 |
GluR2発現抑制のためのRNAiアデノウイルスの作製を以下の通りに行った。ヒトH1プロモータの制御下にサイレンシングRNA(small interfering RNA、RNAi)の発現ユニットをもち、その下流にGFPの発現ユニットを持つプラスミド(psiRNA-hH1GFPZeo-G2,invivogen社)を鋳型に、発現ユニットとGFP部分を挟んでPCR増幅し、これをプラスミドpDONR221(Invitrogen社)に組換え、pENTR-H1-GFPを作製した。次に、このプラスミドのH1プロモータの下流にAMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2 cDNAの短い配列(マウス・ラット共通の配列)を挿入し、アデノウイルス作製用ベクターpAd/PL-DEST(Invitrogen社)に組換え、これを293A細胞に遺伝子導入し、GluR2の発現を抑制するアヂノウイルスベクターを得た。次に、このアデノウイルスベクターの効果を、GluR2を内在的に発現するType Iアストログリア培養細胞を対象に調べた。生後1日齢のC57BL/6マウスの前脳を0.5mm角に刻み、10分間トリプシン処理後分散し、脳1匹あたり75cm^2の培養フラスコに播いた。培養1週間後にコンフルエントになった時点でシトシンアラビノシドを24時間投与し、通常培地に戻して震盪後、97%以上の細胞がType Iアストログリア細胞からなるサブカルチャーを作製した。この細胞にアデノウイルスベクターを感染させたところ、内在的に発現するGluR2は感染後3日目で半分以下になり、5日目でほぼ消失したが、8日目で再度発現が増加した。GluR2量の変化がアストログリア細胞の形態、分裂能、移動性およびグルタミン酸感受性に対して与える影響について解析した。
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