神経回路形成のキー分子であるG蛋白質の活性化イメージングによる立体的解析

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16500242
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 中村 岳史 大阪大学, 微生物病研究所, 講師 (60362604)
• 研究分担者: 黒川 量雄 (独)理化学研究所, 中野生体膜研究室, 研究員 (40333504)
• キーワード: 海馬神経細胞 / Rho / 神経細胞 / FRETプローブ / PI3キナーゼ

研究概要

マウス海馬神経細胞の後シナプス構造体であるスパインにおけるRhoファミリー(RhoA/Rac1/Cdc42)についてFRETプローブ分子を用いて活性化イメージングを行った。アデノウイルスベクターを開発し、マウス海馬神経細胞にFRETプローブの導入を行った。その結果、RhoA、Rac1、Cdc42いずれもスパイン上で局所的に活性化していることが見出された。スパインの形状が記憶や学習に密接に関与することが近年明らかになってきており、これらの結果はRhoファミリーがスパインの形態を制御することで記憶や学習に関与していることを示唆している。
一方、神経突起先端部での「PI3キナーゼ・GEF・Rac/Cdc42」のポジティブフィードバック制御について、PC12細胞を用いてさらに研究を進めた。FRETプローブと様々な阻害剤を組合せた実験結果を基に、GENESIS/Kinetikitプログラム上でシグナル伝達経路をモデル化し、シミュレーションによる解析を行った。その結果、PI3ホスファターゼとPI5ホスファターゼがPIP3の量の維持に重要な働きをしていることが予測された。そこで次にRNAi法を用いてPI3ホスファターゼであるPTENとPI5ホスファターゼであるSHIP2のノックダウンしたところ、NGF刺激におけるRac1とCdc42の活性化、及びPIP3の蓄積が著しく亢進すること、また神経突起の異常形成が観察された。これらのことから、Rac1とCdc42の時空間的な活性制御とそれに伴う神経突起の形成において、PIP3のホスファターゼであるPTENとSHIP2が重要な役割を果たしていることが明らかになった。

研究成果

• [雑誌論文] Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 97 ページ: 8-15
• [雑誌論文] Dynamics of the RAS/ERK map kinase cascade as monitored by fluorescence probes. (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujioka, A., Terai, K., Itoh, R.E., Aoki, K., Nakamura, T., Kuroda, S., Nishida, E., Matsuda, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. (In press)
• [雑誌論文] Local PIP3 accumulation recruits Vav2 and Vav3 to activate Rac1/Cdc42 and initiate neurite outgrowth in nerve growth factor-stimulated PC12 cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Aoki, K., Nakamura, T., Fujikawa, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Mol.Biol.Cell 16 ページ: 2207-2217
• [雑誌論文] FRET imaging in nerve growth cones reveals a high level of RhoA activity within the peripheral domain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Mol.Brain Res. 139 ページ: 277-287
• [雑誌論文] Monitoring spatio-temporal regulation of Ras and Rho GTPase with GFT-based FRET probes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Methods 37 ページ: 146-153
• [雑誌論文] Mechanism and role of localized activation of Rho-family GTPases in growth factor-stimulated fibroblasts and neuronal cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa, K., Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • 雑誌名: Biochem.Soc.Trans. 33 ページ: 631-634
• [雑誌論文] Involvement of the c-Src-Crk-C3G-Rap1 signaling in the nectin-induced activation of Cdc42 and formation of adherens junctions. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukuyama, T., Ogita, H., Kawakatsu, T., Fukuhara, T., Yamada, T., Sato, T., Shimizu, K., Nakamura, T., Matsuda, M., Takai, Y.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 815-825