| 研究概要 |
HCT116 p53(+/+) (vector control)とp53(-/-)細胞を、Johns Hopkins大学Vogelstein博士から、分与してもらい、これらの細胞を、FACS (Epics Elite ; Beckman Coulter, Fullerton CA)で、細胞周期のどの時期にあるかによりソーティングした。
1度に行う操作は、10^8個細胞をIsoton (Beckman Coulter)に懸濁して、毎秒500個の割合で注入。蛍光強度別にソーティングする。蛍光強度の高いほうのピークをG1としはじめの部分をG0とする。その間をS期として、横軸(蛍光強度)を二等分点をとり、その前半および後半をS期の前半および後半の細胞として分取した。それぞれ一度に10^5個ほど採取することができた。そのDNA(それぞれ500ng)を抽出して、affimetrix microarray装置の、100K chipでゲノムワイドに検討するため、それぞれにつきXbaI,HindIIIで制限酵素消化した。これらを、hybridizationして、そのcall (100K SNP data)をdownloadした。
一方、スタート細胞を10^6個から出発し前半部位のみをとり、genome-wide amplification kitを用いてできるだけ均等に増幅したDNAを、Filgen社性のexpression DNA arrayとhybridizationを行った。
これらのdataを数値的にallele dosageを推定するソフトウェアで変換後、p53のknock outにより、複製タイミングがゲノムワイドにどのようにかわるかを検討していく。
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