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マウス精子形成過程で半数体精細胞特異的に発現するTact1はイントロンレス遺伝子で、内部に存在するCpGアイランドのメチル化によって、体細胞における遺伝子発現が抑制され、脱メチル化が精細胞での発現に必須であることを明らかにしてきた。本年度は脱メチル化および再メチル化の時期の特定と、再メチル化機構の検討を行った。lazer microdissectionおよびelutriationによって精原細胞、精母細胞さらに精細胞を純化し、精子は精巣上体尾部および輸精管から単離した。これらの生殖細胞から抽出したゲノムDNAを用いてBisulfite-PCR-sequencingによってTact1遺伝子内部のメチル化パターンを調べた。その結果、Tact1遺伝子内部のCpGアイランドは増殖期の精原細胞で脱メチル化が始まり、精母細胞では完全に非メチル化状態となり、この状態は遺伝子が発現する精細胞から発現を終えた精巣上体精子まで継続し、その後輸精管に移動した精子核内で再メチル化されることが明らかとなった。次に新規DNAメチル化酵素であるDnmt3aとDnmt3bの精子再メチル化に対する役割を解析するために、生殖系列特異的コンディショナルKOマウスを用いて輸精管内精子のTact1遺伝子のメチル化を調べたところ、どちらのKOマウスにおいても正常にメチル化されていた。このことは両者のメチル化に対する作用が重複しており相互補助する可能性を示唆している。精子核内ゲノムDNAはほとんどがプロタミンにより凝縮されているため、外来タンパク質分子のゲノムへの接近はほとんどできないと考えられている。またゲノムの領域特異的新規メチル化はヒストンメチル化と関連する可能性がある。そこで、精子核内でメチル化される領域にピストンが残存する可能性を調べた。プロタミン分子間S-S結合を解離後、固定し、micrococcal nuclease切断し、抗ヒストン抗体を用いてChIPアッセイを行ったところ、Tact1遺伝子はnucleohistone領域に存在することが明らかとなった。これらは生殖系列におけるゲノムのエピジェネティカル変動機構解明に手がかりを与える新知見である。
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