| 研究概要 |
tRNAアンチコドン一字目に見出される修飾ウリジンのうち,5-メチルウリジン誘導体については,真核生物型のものはコドン三字目のグアノシンと対合できず,原核生物型のものは対合できること,および,原核生物型での対合の際には当該修飾ウリジンがイオン化していることを,作業仮説として仮定し,これが正しいか検証するために,まず,グアノシン誘導体をmRNAの特異的な位置に導入する方法を確立した.まず,大腸菌の核酸代謝酵素を用いて,6-チオグアノシン5'-リン酸を調製することに成功した.これを踏まえて,転写法により,グアノシン誘導体をRNAの5'-末端に特異的に取り込まれるか検討したが,少なくともイノシンの場合は導入効率が低く,実用的でなかった.一方,化学合成でイノシンを導入したオリゴリボヌクレオチドを用いて,RNAリガーゼによるRNAの連結を試みた.反応効率を考慮し,従来の方法ではなく,RNA二重鎖を効率よく連結できることが平成16年春に報告されたT4 RNAリガーゼ2を用いて連結反応を試み,その方法を確立した.これについては,第27回日本分子生物学会年会で報告した.一方,転写法により,イノシンをRNAの特定部位に導入する方法を試み,問題なく導入できることを確認した.また,DNAzymeにより調製したRNAの末端を均一に揃えることが可能であることも確認した.以上の方法を組み合わせて調製したmRNAを大腸菌無細胞タンパク質合成系に添加して,mRNAの構造による活性の違いを比較するためには,mRNAを全く同じ方法で精製する必要があることがわかった.以上より,本研究の目的に関わる実験方法をほぼ確立した.
|
