| 研究課題/領域番号 |
16570102
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 関西学院大学 |
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研究代表者 |
山口 宏 関西学院大学, 理工学部, 助教授 (10252719)
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| 研究分担者 |
木下 勉 関西学院大学, 理工学部, 教授 (30161532)
佐藤 衛 横浜市立大学, 大学院・国際総合科学研究科, 教授 (60170784)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2006
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| キーワード | Notchシグナル / 発現条件 / 精製 / 結晶化 / 溶液構造 / X線小角散乱 |
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| 研究概要 |
Notch情報伝達系は、発生過程の多くのステージにおいて未分化の神経幹細胞の維持や分化を制御している。Notch情報伝達系でヘテロ三量体を形成する、細胞内ドメイン(NICD)、SuppressorofHairless(Su(H))、Mastermind(Mam)に着目し、このシグナル伝達・分化制御機構をタンパク質分子レベルで解明するために研究を遂行した。
X-NICD、X-Su(H)、X-Mamの発現精製条件を検索した結果、大量発現には成功するものの物理化学的に均一な試料として精製する事はできなかった。X-NICD中の機能ドメインである、アンキリンリピート(X-ANK)およびRamドメインに関しては、X-ANKおよび二つのドメインが連続したX-mm-ANKを高純度に精製する事に成功した。X-ANKおよびX-RAM-ANKの溶液状態での会合状態を動的光散乱実験により解析した結果、X-ANKは単分散であるがX-RAM-ANKは非常に大きな多分散度が得られ、多様な会合状態として溶液中に存在している事が明らかになった。そして、CDスペクトルを用いて精製標品のα一ヘリックス含有量を計算したところ、X-RAM-ANKにおけるRAMドメインは二次構造を取っておらず、非天然構造である事が示唆され、濃縮時の非特異的な凝集は、mmメインの非天然構造部位間で相互作用を形成して生じている事が考えられた。さらに、X-ANKの構造学的知見を得るために、X線小角散乱法を用いた実験を行い、慣性半径、分子内最大長を算出し、さらにabinitio法を用いDummyAtomModelを求めた。その結果、X-ANKの二量体を形成しているR値0.13%のモデルを得る事ができた。分子の形状は、最大長105.5Å、幅が約40Å、突出部分の幅が約53Åの凸型が背中合わせで二量体を形成しており、ショウジョウバエ由来ANKモデルを問題なくフィッティングする事ができた。X-ANKの結晶化条件検索も進め、PEG400を沈澱剤として、結晶を得る事に成功した。また、これ分子の機能解析も進め、新たな知見を得ることに成功した。
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