| 研究課題/領域番号 |
16570139
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
鈴木 治和 独立行政法人理化学研究所, 遺伝子機能探索技術研究チーム, チームリーダー (80333293)
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| 研究分担者 |
金森 睦 独立行政法人理化学研究所, 遺伝子資源解析研究チーム, チームリーダー (20373293)
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| キーワード | タンパク相互作用 / -ハイブリッド / P53 / in vitroプルダウンアッセイ |
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| 研究概要 |
転写活性ドメインがN末に存在することが分かっている転写制御因子P53について、VP16との融合蛋白質を発現するコンストラクトを作成して哺乳動物細胞2ハイブリッド法(M2H)により、結合するGal4融合蛋白質をスクリーニングした。その結果、顕著なレポーター活性を示すものが2つ取れてきた。一つはmdm2であり、P53との相互作用は既に報告されている。もう一つは推定分子量17kDaの機能未知の蛋白質であった。まず、この蛋白質とP53をタグ付き蛋白質として細胞に発現させ、免疫沈降を試みた。両蛋白質ともタグ付き蛋白質としての発現は確認できたが、細胞レベルでの相互作用証明はできなかった。そこでin vitroでの相互作用を調べてみた。我々はこの目的のために、迅速にin vitroプルダウンができる手法を開発して論文報告した。この方法は特定のタグが付いた融合タンパク質を準備する必要が無く、サンプル調製から結果解析まで1日以内に終了することができる画期的手法である。実際に相互作用を調べてみると、コントロールのP53-ラージTでは明確な相互作用が認められたが、スクリーニングされた蛋白質とP53との相互作用は確認されなかった。M2Hの結果は再現性があるのに相互作用が確認されない結果となり、これ以上の解析を中止した。現在、転写活性化能を持つ転写制御因子遺伝子と転写関連遺伝子群との相互作用をM2Hにより網羅的に調べている。これらスクリーニングで得られる新規相互作用を対象にして次年度での解析を行う予定である。
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