| 研究課題/領域番号 |
16570141
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
名川 文清 東京大学, 大学院・理学系研究科, 講師 (10241233)
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| 研究分担者 |
西住 裕文 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (30292832)
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| キーワード | 抗原受容体遺伝子 / V(D)J組換え / RAGタンパク質 / フットプリント解析 / 3'末端プロセシング |
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| 研究概要 |
抗原受容体遺伝子の活性化と多様化に必要なV(D)J組換えには、組み換えシグナル配列(recombination signal sequences : RSS)及び組み換え活性化遺伝子(recombination activating gene : RAG)の産物であるRAGタンパク質が必須である。この組み換えにおいて、RAGタンパク質はまずRSSに結合し、coding配列とRSSとの間に2重鎖切断を導入する。その結果、signal end(SE)側には平滑末端が、一方coding end(CE)側にはhairpin構造が形成される。hairpin構造を持つCEは、まず開環され、次に末端がプロセスされた後、最終的に結合され、functionalな抗原受容体遺伝子が形成される。我々は、本研究でin vitroでの再構成実験を行い、RSS切断後にRAGタンパク質が果たす2つの重要な役割について明らかにした。
まず、CEに相当する合成DNAをSE complexに取り込ませることにより、CEを含むpost-cleavage型複合体をin vitroで再構成することに成功した。このpost-cleavage型複合体をフットプリント法で解析したところ、CEとして取り込まれた合成DNAは末端から十数塩基対にわたってRAGと強く相互作用することが示された。また、RAGのjoining変異体を用いると、CE型DNAがSE complexに取り込まれず、切断前のpre-cleavage複合体においてもcoding領域とRAGとの相互作用が低下していることが示された。これらの観察は、RAGタンパク質がRSSの切断後もcoding領域と相互作用し、CEの3'末端のプロセシングやligation反応の為の場を提供している可能性を示している。
我々は更に、上にのべたpost-cleavage複合体の中で、2つのステップからなるCEの3'末端プロセシング反応が起こることを見出した。CEに相当する基質DNAとして3'突出末端を持つ二本鎖DNAを用いると、その3'オーバーハング構造がSEにtransferすることが見いだされた。こうして生じた3'突出SE中間体は、速やかに解消し、3'オーバーハング構造は一本鎖環状DNAとして放出される。ここで観察されたstrand transfer反応は、in vivoで見られる開環されたヘアピンCEの3'ヌクレオチド欠失反応に相当するのではないかと考えられる。
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