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(1)コヒーシン・コンデンシンの機能解析:姉妹染色体を繋ぎとめているコヒーシン複合体(Rad21、Scc3、Smc1、Smc3)や分裂期特異的に染色体凝縮を行うコンデンシン複合体(Smc2、Smc4、Scc2、Scc4)は細胞周期によってリン酸化・脱リン酸化・メチル化・アセチル化されることがわかっている。コヒーシン・コンデンシンの構成蛋白のリコンビナントに実際的な修飾を行い、切断活性を比較することで、部位特異的な修飾が染色体分配へ如何なる影響を与えているかの検討を行った。
(2)FRET法を用いたコヒーシン蛋白群の細胞内機能解析:Rad21蛋白はコヒーシンの構成蛋白で姉妹染色体分配の際にセパラーゼによって切断される。Rad21蛋白のN末端側にYFP蛋白、C末端側にBFP蛋白といった異なる色の蛍光標識蛋白との融合蛋白を培養細胞内に発現させ、FRET法を用いて分裂期進行に伴って細胞内の何処に蓄積し、何時、どのように切断されるかを発色の違いにより観察を行う予定であるが、本年度はこの発現プラスミドの構築を行い、安定強制発現株を確立し、現在解析を行っている。
(3)相互作用因子の探索:セパラーゼの活性を制御している因子は現在までにセクリンの結合とCdc2/cyclin B (MPF)によるリン酸化しか報告されていないが、ヒトのセクリン、セパラーゼ、コヒーシンと結合する因子を、各々をプローブにし、酵母two-hybrid、ウェストウェスタン法などを用いて相互作用する因子を単離・同定するための、発現コンストラクトを作成中である。
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