| 研究概要 |
1.Pseudomonas由来pVS1のDNA複製タンパク質遺伝子repA〔高コピー型、野生型、低コピー型(LC)の3種〕と、プラスミド安定化領域(parとstaAの2種)を適当に組み合わせ、アグロバクテリウムで安定に維持される小型プラスミド骨格群を作製した。うち5種にPnos::Hyg^RマーカーとP35S::gusAレポーター遺伝子を組込んだ超小型バイナリーベクターを構築した。これら5種の小型バイナリーベクターは8.6〜9.65kbと非常にコンパクトである上、Hyg^RとgusA遺伝子間に4種のマルチクローニング部位(MCS)を有する。またgusAとGateway部位特異的組換えカセットとの置換により、3種類のGateway対応ベクターを得た。
2.アグロバクテリウムに組込んだ上記5種の小型ベクターを組織培養を介した形質転換法によりイネに、またfloral dip法によりシロイヌナズナに形質転換した。その結果、何れのベクターもイネおよびシロイヌナズナ双方に良好な形質転換効率をもたらした。また、各種ベクター個別導入Hyg^RシロイヌナズナT1後代系統から各10個体の幼植物体を選んでGUS活性染色に供したところ、全50個体でGUS活性が観察された。さらに、形質転換イネのサザン解析の結果、repA-LC+staAを組み込んだpSTARH301G形質転換イネにおいて、導入T-DNAコピー数の低減効果が見られた。
3.イネ由来の除草剤耐性(2点変異)型アセト乳酸合成酵素遺伝子(mALS)に関し、1,368および557bpの長短2種のプロモーター配列を有し、コード領域中のHindIII認識部位を消失させたmALSサブクローン(インサート:各3789および2978bp)を得た。これらmALSカセットを2種の小型ベクターpSTARH301GとpPARH501Gに組込み、合計4種のmALSバイナリーベクターを構築した。これらをアグロバクテリウム経由でイネに形質転換したところ、何れにおいても良好な形質転換結果を得た。
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