| 研究概要 |
本研究では遺伝子改変が容易な酵母の遺伝子発現系を利用し、単一アリルからなるチューブリン蛋白質の発現・精製を行うことにより、これまで解析が難しかった単一のアリルチューブリンの重合・不安定性に関する生化学的解析を行うとともに、変異チューブリンを発現・精製することにより、微小管結合タンパク質や微小管作用薬との相互作用や結合部位の解析を行うことを目的とする。今年度はヒトα-チューブリンとヒトβ-チューブリンのみを発現した酵母の作成を試みた。それぞれのシャッフルストレインにてヒトチューブリンのみを発現する酵母の作成を試みたところ、いずれも生育する株を得ることが出来なかった。酵母とヒトのチューブリン間ではC末端の配列が大きく異なり、わずかな違いにより生育できなくなる場合もあることから、ヒトチューブリンのみを発現する酵母は得ることが出来ないと考えられる。次に動物のチューブリンに対し重合安定化能を示すタキソールに対し感受性となる酵母チューブリンTUB2-A19K,T23V,G26D発現酵母の作成を行った。作成した酵母はタキソール感受性を示さなかったが、発現酵母から精製したチューブリンはタキソールにより重合が安定化することが確認された。またα-チューブリンに共有結合して微小管重合を阻害することが明らかとなった低分子化合物ピロネチンの結合部位を変異したチューブリンTUB1-K353Aのみを発現した酵母の作成を試みたが、生育する株は得られなかった。このことからピロネチン結合部位は微小管の重合・脱重合に重要な部位であると予想された。そこで野生型TUB1を持った状態でTUB1-K353Aを発現した酵母を作成し、ピロネチン感受性を検討したところ、部分的ではあるがピロネチン耐性を示した。
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