| 研究概要 |
メラトニン合成酵素のレドックス制御について以下の結果を得た。
(1)活性に必要なシステイン残基の同定
NATには種間に保存されている5つのシステイン残基(37,61,75,158,177番目)が存在する。Acetyl CoAの前処理によりNEMによる活性阻害が抑制されることから,^<14>C-NEMを用いてAcetyl CoA存在下,及び非存在下における^<14>C-NEMの取り込みを比較した結果,61及び177番目のシステインが活性に重要であることを見出した。このことはC61A(61番目のシステインをアラニンに変えたもの)及びC177A(177番目のシステインをアラニンに変えたもの),またC61A/C177A(61番目及び177番目のシステインをアラニンに変えたもの)のdouble mutantがNEMの処理により失活しなかったことからも示唆された。
3.分子内ジスルフィド結合の同定
分子内-S-S-結合の同定を行った。まず,NATをAcetyl CoAで処理することによりCys61及びCysl77を保護し,活性に関係のないシステインをNEMで修飾した。その後DTT存在下または非存在下5時間透析を行い,各々還元型または酸化型を調製した。V_8 protease消化後,それぞれ酸化型または還元型だけに見られるフラグメントをHPLCにより単離・精製した。酸化型から得られたフラグメントをDTTにより還元処理すると2本のフラグメントが得られ,各々還元型から得られたフラグメントと一致した。この2本のフラグメントのアミノ酸配列を調べた結果,Cys61及びCys177が含まれていた。
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