AAA-ATPaseSKD1によるユビキチンシグナル依存性膜蛋白質選別機構の解明

2005 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 16590050
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 藤田 英明 九州大学, 大学院・薬学研究院, 助手 (80291524)
• 研究分担者: 田中 嘉孝 九州大学, 大学院・薬学研究院, 教授 (20217095)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• キーワード: メンブレントラフィック / リソソーム / エンドソーム / ユビキチン / 多胞体様構造物 / 蛋白質分解

研究概要

本研究はエンドソームにおける膜蛋白質のユビキチン化とそれに続く選別輸送の分子機構を明らかにすること、これまで同定したSKD1結合蛋白質について機能解析を行い、エンドソームにおけるMVBの形成および膜蛋白質選別輸送の分子機構を明らかにすることを目的として行った。
1)SKD1(E2350)過剰発現により蓄積するユビキチン化膜蛋白質の網羅的プロテオミクス解析:
アデノウイルスを用いた変異型SKD1(E235Q)発現によりエンドソームに蓄積するユビキチン化蛋白質を、細胞分画およびユビキチン抗体カラムを用いたアフィニティクロマトグラフにより精製した。得られたユビキチン化蛋白質をトリプシン消化後に質量分析法(ESI-LC-MS/MS)による網羅的プロテオーム解析を行い、ユビキチン化によりその局在が制御されている膜蛋白質を少なくとも20種類同定した。さらにこの中から8種類の膜蛋白質についてユビキチン化フォームの検出(ウエスタンブロッティングでラダーとして検出)あるいは変異型SKD1(E235Q)発現依存的な局在の変化を認めた。
2)SKD1結合蛋白質SBP1・SBP3(mVPS2p/CHMP2A)の機能解析:
可溶性細胞質蛋白質であるSBP1はそのC末部分のCoiled-coilドメインを介してSKD1と相互作用すること、SKD1(E235Q)の過剰発現によりSKD1とともに巨大蛋白質複合体を形成しエンドソーム膜上へと局在することなどを報告した。またSBP1のヒトホモログlip5(lyst-interacting protein 5)はリソソームの形態異常を示すChediak-Higashi Syndromeの原因遺伝子であるlyst(lysosomal trafficking regulator)に結合することから、SKD1/SBP1が何らかの形でlystの機能発現制御を行っている可能性が高い。SKD1(E235Q)を過剰発現させた細胞で可溶性膜蛋白質であるlystが膜画分へ局在変化することを明らかにした。さらにSBP3がSKD1とESCRT-IIIの相互作用に関与していることを明らかにした。

研究成果

• [雑誌論文] The NH_2-terminal transmembrane and Iumenal domains of LGP85 are needed for the formation of enlarged endosomal /lysosomal compartments (2005)
  • 著者名/発表者名: T.Kuronita, H.Fujita et al.
  • 雑誌名: Traffic 6 ページ: 865-906
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The NH_2-terminal transmembrane and lumenal domains of LGP85 are needed for the formation of enlarged endosomal/lysosomal compartments (2005)
  • 著者名/発表者名: T.Kuronita, T.Hatano, A.Furuyama, Y.Hirota, N.Masuyama, P.Saftig, M.Himeno, H.Fujita, Y.Tanaka
  • 雑誌名: Traffic 10 ページ: 895-906
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Mammalian class E Vps proteins, SBP1 and mVps2/CHMP2A, interact with and regulate the function of an AAA-ATPase SKD1/Vps4B (2004)
  • 著者名/発表者名: H.Fujita et al.
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 117 ページ: 2997-3009
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Mammalian class E Vps proteins, SBP1 and mVps2/CHMP2A, interact with and regulate the function of an AAA-ATPase SKD1/Vps4B (2004)
  • 著者名/発表者名: H.Fujita, Y.Umezuki, K.Imamura, D.Ishikawa, S.Uchimura, A.Nara, T.Yoshimori, Y.Hayashizaki, J.Kawai, K.Ishidoh, Y.Tanaka, M.Himeno
  • 雑誌名: J.Cell Science 117 ページ: 2997-3009
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より