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Differentiation-inducing factor(DIF)は濃度依存性にHeLa細胞の増殖を抑制し、これはサイクリンD1の分解促進・mRNA発現抑制による細胞周期拘束のためであるという知見を得た。また、DIFはglycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)を活性化することによりこの作用を発揮していることが示唆された。
DIFによるサイクリンD1分解機構を解明するため、ヒトサイクリンD1の変異体を作製した。ヒトサイクリンD1の遺伝子配列には、その分解に関係しているとされるアミノ酸が4箇所報告されている。(1)destruction boxを構成するArg^<29>、(2)destruction boxを構成するLeu^<32>、(3)GSK-3βによってリン酸化を受けるとされるThr^<286>、(4)dual-specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinase 1B(DYRK1B)によってリン酸化を受けるとされるThr^<288>、以上の4箇所である。上記4種類のサイクリンD1の変異体を作製し、それらに及ぼすDIFの効果を検討したところ、サイクリンD1の286位と288位のThrのリン酸化がDIFによるこのタンパク質の分解促進に大きな役割を果たしていることが明らかとなった。
そこで、それぞれのThrをリン酸化する責任分子であるGSK-3βとDYRK1BのsiRNAを用いてこれらのリン酸化酵素の関与について検討したところ、DIFによるサイクリンD1のリン酸化にはこれら2つのリン酸化酵素が関わっていることが明らかとなった。以上の結果からDIFは少なくとも2つのサイクリンD1リン酸化酵素を活性化することにより、サイクリンD1の分解を速やかにかつ強力に引き起こしていることが示唆された。
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