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申請者らは、マウスBTB転写因子GetB(CIBZ:CtBP-interacting BTB zinc finger protein)をRTーPCR法より同定した。CIBZの転写調節機構を明らかにする目的で以下の成果が得られた。
1、転写制御。
レポーターアッセイを用いてCIBZが二つ独立する転写抑制ドメイン、活性化ドメインをそれぞれ同定した。転写抑制ドメインをbaitにしyeast two-hybrid assayを行った結果、CtBPという転写制御因子と結合することを見出した。CIBZはCtBPとin vitroとin vivoにて結合すること、過剰発現のCIBZがCtBPをセントロメアクロマチンにリクルートすること、CIBZの転写抑制にはCtBPとの結合が重要であること、CIBZ・CtBPの転写抑制には脱アセチル化酵素が関与することを明らかにした。
2、SUMO化。
CIBZはin vivoでSUMO化されることが確認された。E2酵素反応を特異的に阻害するdominant negative-ubc9をCIBZ及ひSUMO1と共発現させた場合、CIBZのSUMO化か顕著に低下した。現在、PIASyはCIBZのSUMO化のE3酵素の一つであること、ψKxD/E配列以外の非コンセンサスなアミノ酸がCIBZのSUMO化に関与する可能性が考えられる。
3、メチル化。
CIBZのZF3-5はメチル化されたCpGジヌクレオチドに結合することがゲルシフトアッセイにより確認した。
4、CIBZ遺伝子破壊マウス。
この遺伝子エクソンの両端を挿入した約17Kbのtargeting vectorを作製し、エレクトロポレーション法によりES細胞に導入し、G418を用いて252個の薬剤耐性ESクローンを選択した。得られたESクローンからゲノムサザンを行い、二つ相同組み換えが確認されたESクローンを樹立した。
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