| 研究概要 |
NOの核酸ニトロ化によって生じる修飾核酸8-ニトログノアシン(8-NO_2Guo)およびその関連化合物である8-ニトロサイクリックGMP(8-NO_2-cGMP)を想定して、細胞内シグナル伝達機構について解析をおこない、以下の知見を得た。
(1)抗8-NO_2Guo単クローン抗体を用いて、共焦点レーザー顕微鏡の免疫電顕等の免疫細胞化学的解析をおこなったところ、ヒト肝癌由来株化細胞HepG2細胞の細胞質の特に小胞体近傍に局在することが明らかになった。また、グルコース飢餓によりHepG2細胞の細胞死を誘導する系において、8-NO_2Guoは、heme oxygenase-1の発現誘導やbcl-XL、eNOSの発現維持などを介して細胞保護作用を示した。
(2)8-NO_2GuoにDNAやRNAに対して変異原性があることが見出された。AS52細胞のゲノムDNA遺伝子変異率が上昇し、その変異パターンはG→Tが優勢であった。また、RNAウイルスであるGFP-センダイウイルスの変異率が上昇し、その変異パターンはC→Uが優勢であった。これらの要因として、8-NO_2Guoがゲノム中に組込まれるや8-NO_2Guoから生じたO_2による酸化的塩基損傷などが考えられた。
(3)8-NO_2-cGMPの有機合成法を確立し、高純度の8-NO_2-cGMPを調製した。ヒト子宮平滑筋初代培養細胞に添加するとcGMPアナログ(8-Br-cGMP)と同様にPKGを活性化した。また、ラット頚動脈より採取した血管標本(平滑筋細胞のみ)を、α_1アドレナリン受容体アゴニスト(フェニレフリン)により収縮させた後に、8-NO_2-cGMPを添加すると平滑筋が弛緩した。すなわち8-NO_2-cGMPは、生体内で全く新しいcGMP誘導体として機能していることが示唆された。
(4)抗8-NO_2-cGMP単クローナル・ポリクローナル抗体を調製し、免疫細胞化学的解析をおこなった。マウスマクロファージ由来株化細胞RAW264細胞を用いて、IFN-γとLPSの共刺激によりiNOSの発現誘導をおこないNO産生を亢進させると細胞質が濃染された。また、培地上清中に含まれる8-NO_2-cGMPをHPLC-電気化学的方法により検出し、生体内に8-NO_2-cGMPの存在を世界で初めて明らかにした。
以上より、NO/8-NO_2Guo,8-NO_2-cGMPが生体内のレドックス応答に関与する新しいシグナル伝達分子であると同時に変異原性物質であることが明らかになってきた。
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