| 研究概要 |
C型肝炎ウイルス(HCV)の部分RNAゲノム自己複製単位(レプリコン)が複製している細胞を用いて,細胞性因子を含めた複製複合体の構造とそれぞれの構成因子のHCVゲノム複製反応における機能を解析することによりHCVゲノム複製機構を分子レベルで明らかにすることを目的として研究をおこなった。本年度、まず全長ゲノムを発現するレプリコンを作成し、これまで用いてきた部分ゲノムレプリコン細胞におけるレプリコンRNA複製複合体の生化学的な性質との検討をおこなった。その結果、全長ゲノムからウイルス構造タンパク質が発現された場合でも基本的な複製複合体の構成ならびに性質は変化せず、これまでの部分ゲノムレプリコン細胞がHCVゲノム複製複合体解析のために良い実験系となることが確認された。そこで、この部分ゲノムレプリコン細胞をジギトニンを用いて膜透過性化した後、プロテアーゼ処理をおこない複製複合体に含まれないHCVタンパク質の除去をおこなった。その後、この細胞を種々の化学クロスリンカー剤で処理した後、個々のHCVタンパク質の検出をおこないそれらタンパク質間の相互作用の検討をおこなったが、効率良く、特異的に複製複合体をクロスリンクする試薬は今のところ見つからなかった。また、同時に、このレプリコン細胞におけるレプリコンRNA複製を抑制する因子を同定しその抑制のメカニズムを解明することから、複製複合体形成機構を解析する試みをおこなった。その結果サイトカインのひとつであるTGF-betaでこの細胞を処理する事によりレプリコンの複製が著しく阻害されることを明らかにした。TGF-betaのシグナル伝達系の中で何がこの抑制に関わっているのか解析をすすめたところ、TGF-betaによるSmadの転写活性化に依存して、この抑制効果が現れることがわかった。
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