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当初の計画ではグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST) pull down法によるPrP結合分子の同定を行う予定であった。しかし、全長PrPまたはN-末半分のPrPをGSTと融合し大腸菌にて発現させると、inclusion bodyを形成し可溶化が困難であった。そのため、GST融合PrPを精製することが出来なく、GST pull down法を用いたPrP結合分子の同定を行うことを断念しなければならなかった。そこで申請者は、yeast-two hybrid法を用いてPrP結合蛋白を同定することにした。ベイト蛋白として、PrPのN-末半分(PrP23-120)とPrP特異的オクタペプチドリピート(OR)を欠損するN-末半分(PrP23-120ΔOR)を発現するコンストラクトを作製した。これらを酵母に導入した結果、ウェスタンブロッティングにてこれらの蛋白の発現を確認した。また、これらの蛋白の細胞毒性を調べた結果、細胞増殖に何ら影響がないことも分かった。さらに、レポーター遺伝子の転写活性を調べたが、これらの蛋白のみではなんら転写活性を示さなかった。次に、市販のマウス脳cDNAライブラリーが既に導入されている酵母を購入し、PrP23-120を発現する酵母と交配させスクリーニングを行った。その結果、レポーター遺伝子のリーキーな発現があり、一次スクリーニングにて約1万個のコロニーが得られた。このリーキーな発現を抑制するために、レポーター遺伝子の一つであるHISの拮抗剤である3-アミノ-1-2-4-トリアゾール(3-AT)の効果を検討した。その結果、15mM〜20mM 3-ATでネガティブと思われるコロニーがほとんど検出できなくなった。そこで、15mM 3-ATを用いて再度スクリーニングを開始した。
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