| 研究概要 |
ヒト肝臓由来のcDNAより制限酵素部位(Kpn IとEco RI)を附加したプライマーをデザインしてPCR法によってXI因子遺伝子cDNAの作製し、クローニングペクターpCR2.1にライゲーションして、第XI因子遺伝子cDNA/pCR2.1をえた。
PCR法によってXI因子分子599位のTrp(W)をcodeする塩基をアミノ酸の構造と性質が各々異なるArg(R)、Gly(G)およびGlu(E)の変異型第XI因子遺伝子/pCR2.1をえた。XI因子wild type cDNAおよびXI因子変異型遺伝子を発現ベクタpcDNA3.1Zeoにライゲショーンして、精製XI因子wild type cDNA/pCDNA3.1Zeoおよび各々のXI因子599位変異型遺伝子/pcDNA3.1Zeoを作成した。これらを用いてCOS-1細胞で遺伝子組み換え型XI因子を発現した。さらに、XI因子wild type cDNA/pCDNA3.1ZeoおよびXI因子変異型遺伝pcDNA3.1ZeoをCHO-K1細胞にトランスフォーメイションし、Zeodin選訳によって安定株を確立した。
COS細胞を用いた一過性発現では培養液中のXI599R, XI599EとXI599GのXI因子抗原は正常レコンビ蛋白質のそれぞれ1%以下であった。細胞内のXI因子抗原は野生型の67〜70%であった。
また、コンピュターグラフィックスを用いた構造モデルからW599はFXI分子のC末端領域のα-ヘリックスに属することが分かった。このアミノ酸残基はヒト、ウサギ、ウシ、ラット、マウスのFXIの間で構造前に保存されている。FXI分子のC末端のα-ヘリックスに属する599Wは構造的に細胞からの分泌に重要であると推察した。
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