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1.In vitroにおける臍帯血由来細胞の心筋分化能の検討
臍帯血より単核細胞分画を比重遠心法により分離し、さらにmagnet sortingにてLineage(-)分画を採取した。
1)単独培養:採取細胞をαmediumにて3日-7日培養後、培養液をDMEMに変え、分化誘導剤としてi)1%DMSO、ii)インスリン200nM、またはiii)5-azacitidine 1mMを加え、さらに2週間培養した。分化誘導剤投与のタイミング、培養dishのcoating等変え検討したが、いずれの条件においても、心筋特異蛋白の発現は認めなかった。
2)共培養:Lineage(-)単核球細胞を新生仔ラット培養心筋細胞と共培養を行った。2-3週間後、免疫細胞学的検討として、抗ヒト核抗体にてヒト由来細胞を同定、さらに抗actinin抗体、抗ミオシン重鎖抗体、心筋トロポニンT抗体を用いて二重染色を行った。自発収縮細胞は認めなかったが、ヒト由来細胞の一部にactinin・ミオシン重鎖陽性細胞が散見され、ヒト臍帯血由来細胞の心筋分化の可能性が認められた。
2.In vivoにおける臍帯血由来細胞の心筋分化能の検討
Lineage(-)単核球細胞3-600万cellを、5azacitidineを添加したαMEMにて24時間培養後、NOD/SCIDマウス心筋梗塞モデル虚血境界領域に心筋内注入を行った。2、4週間後に心臓を摘出し組織学的検討を行った。抗HLA-DR抗体にてヒト由来細胞を同定し、抗actinin抗体もしくは抗desmin抗体を用いて二重染色を行った。移植2週間後には、ヒト単核球細胞は注入部に多数存在したが、心筋蛋白発現移植細胞は認めなかった。移植4週間後には、HLA-DR、とdesmin(actinin)二重陽性細胞をごく少数認めたが、5azacitidine前処置による心筋細胞への分化効率の増加は認めなかった。また、細胞移植による心機能への影響も心臓超音波検査上、認めなかった。
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