| 研究概要 |
細胞質型ホスホリパーゼA_2(cPLA_2)の522番目のアミノ酸までの蛋白は優位抑制型cPLA_2(dn-cPLA_2)として作用することが報告されていることから,dn-cPLA_2のcDNAをcPLA_2のcDNAを含むpCRII-cPLA_2からPCRにて増幅した後,TAT発現プラスミッドであるpTATのマルチクローニングサイトに挿入し,pTAT-dn-cPLA_2を作製した.また,同様にcPLA_2のcDNAをPCRによって増幅した後にpTATに挿入し,pTAT-cPLA_2を作製した.さらに,site-directed mutagenesisによって,cPLA_2のSer^<505>,Ser^<515>およびSer^<727>をアラニンに置換させたプラスミッド(それぞれ,pTAT-S505A-cPLA_2,pTAT-S515A-cPLA_2およびpTAT-S727A-cPLA_2)を作製した.プラスミッドをBL21大腸菌に導入し培養した後に,buffer Z(8 M urea,20mM HEPES,pH8.0,100mM NaCl)を溶媒としてソニケーションを行い,遠心の後に上清を回収しNi-NTAカラムに通した.イミダゾールにて抽出を行い,ポアサイズが10kDaの透析膜(10,000MWCO Slide-A-Lyzer^<【○!R】>)を用いて,ureaとイミダゾールの除去を行った.また,コントロール蛋白として,特別な機能を有さないとされる蛍光色素であるgreen fluorescent protein(GFP)とTATの融合蛋白(TAT-GFP)を作製した.
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