| 研究課題/領域番号 |
16590759
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
呼吸器内科学
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
中村 豊 岩手医科大学, 医学部, 講師 (60328614)
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| 研究分担者 |
山内 広平 岩手医科大学, 医学部, 助教授 (20200579)
井上 洋西 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40133962)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| キーワード | 気管支喘息 / 遺伝子治療 / decoy oligo / 転写因子 / NF-AT / GATA-3 / Th2-type cytokine / HVJ-envelope |
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| 研究概要 |
ヒト末梢血よりCD3陽性Tリンパ球を分離培養しGATA-3 decoy oligoをtransfectionさせた。4時間後にCD3とCD28とで刺激し、さらに24時間後にリンパ球とその培養上清との検討を行なった。GATA-3 decoy oligoをtransfectionさせた群はoligoをtransfectionしていないcontrol群に比しIL-5 promoter部とのbinding activityが有意に低下していた(EMSA)。特にdecoy oligoを直鎖状にしたもの(lin)と、exonucleaseに対して抵抗を持たせるためにribbon型(Ri)にしたものとを比較しRi群のみが有意に低下していた。リンパ球内に発現しているIL-5 mRNAと培養上清中のIL-5タンパク濃度については、Ri群がcontrol群に比し低下していた(RT-PCR, ELISA)。以上よりGATA-3 decoy oligoは特異的にIL-5産生を抑制することが判明した。次にBALB/cマウスを卵白アルブミン(OVA)で感作し、脾臓からCD3陽性T細胞を分離培養しGATA-3 decoy oligoのtransfectionを行なった。transfectionのために使用するtoolとしてhemagglutinating virus of Japan(HVJ)を使用したところtransfection効率が飛躍的に高まった。新たにBALB/cマウスをOVAで感作し、先のdecoyをtransfectionされたCD3陽性T細胞をそのマウスの腹腔内へ投与した。その後抗原チャレンジを行ないメサコリンに対する気道抵抗の変化を測定し、さらに気管支肺胞洗浄液を回収しIL-5濃度の測定を行なった。しかし、GATA-3をターゲットにしたdecoy oligoは、気道抵抗やIL-5濃度の低下を認めるまでには至らなかったために、Th2-type cytokineを産生する上で特に重要な転写因子であるNF-ATをターゲットにdecoy oligoを作成し上述のごとく実験を繰り返したところ、in vitroにおいてはGATA-3 decoyで抑制効果を認めたIL-5のみならずIL-4、IL-13といったTh2-type cytokine産生を抑制しさらにin vivoにおいてもNF-AT decoy oligoはマウスの気道抵抗を低下させ、かつBAL中のTh2-type cytokine濃度を有意に低下させた。BAL中のCD3陽性T細胞を回収しその核内タンパクを用いてEMSAを行なったところRi群において、NF-ATタンパクとIL-4、5、13のプロモーター部とのbinding affinityは低下していた。これらのことよりNF-AT decoy oligoはCD3陽性T細胞内で転写因子NF-ATとTh2-type cytokineのプロモーター部とのbinding affinityを低下させることによりcytokine産生を低下させていることが証明され、実験的喘息モデルにおいてNF-AT decoyは効果を認めた。
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