| 研究課題/領域番号 |
16590799
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
坂本 尚登 北里大学, 医学部, 講師 (80187046)
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| 研究分担者 |
長場 泰 北里大学, 医学部, 講師 (40255279)
清水 健史 北里大学, 医学部, 助手 (30306568)
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| キーワード | クロライドチャネル / 傍糸球体装置 / モノクロナール抗体 / 発現クローニング / 緻密斑細胞 / 尿細管-糸球体フィードバック |
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| 研究概要 |
腎臓において糸球体内の血流を自動制御する為に尿細管-糸球体フィードバック機構(tubuloglomerular feedback ; TGF)が重要な役割を果たしている。そこで、傍糸球体装置を構成しこの制御機構に関わる細胞を対象にして、遠位尿細管の一部に限局し特殊分化した"緻密斑細胞"に局在するクロライドチャネルの同定を分子生物学的手法を用いて試みている。前年度までの実験で、真核細胞発現ベクター(pcDNAI)で構築したマウス腎臓のcDNAライブラリーを形質導入して作成した培養細胞(COS-7)を対象に発現クローニング法を行い、傍糸球体装置に限局して特異的な染色性を示すモノクロナール抗体(MD12)で認識される培養細胞を得た。次に、標的タンパクを発現した細胞からプラスミドDNAを回収して大腸菌を形質転換し、pcDNAIで構築されたライブラリー由来のプラスミドDNA(JGc1 cDNA)のみを選択的に増幅して、回収したプラスミドのシブ選択(siblingselection)を行い調整し、そのプラスミドをCOS-7細胞へ再び遺伝子導入した。形質導入培養細胞のクローン化は、細胞をMD12抗体で免疫蛍光染色し、陽性となったプールをより少数のコロニーからなるグループに分ける方法を繰り返すことで行い、単一クローン細胞(pcDNAI-JGC1)を樹立した。現在、想定される標的クロライドチャネルcDNAをコードするプラスミドを単離し、クローニングcDNAを導入した強制発現培養細胞を作成して、電気性理学的にチャネル特性の有無について確認する段階である。最終的にチャネルとしてのクローン同定には到っていないが、クローニングが成就したならば、遺伝子改変マウスの作成へ発展させて腎臓における尿細管-糸球体フィードバック機構への関与について分子レベルでの解析を可能としたい。
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