研究課題
基盤研究(C)
GMF強制発現近位尿細管細胞mProx24(GMF-mProx24:Patent WO9927363)におけるH_20_2負荷後の細胞内reactive oxygen species (Ros)亢進と遷延と蛋白尿との関連を検討した。結果、コントロールmProx24細胞では1mg/mlから30mg/mlのアルブミン負荷を行っても細胞死は確認できなかった。しかしGMF強制発現mProx24細胞ではアルブミン1mg/mlにおいて有為な細胞生存活性の低下を認め、30mg/mlまで濃度依存性であることが確認された。トランスフェリン負荷ではコンロトロールおよびGMF強制発現mProx24細胞において細胞生存活性に変化は認めなかった。アルブミンによるGMF強制発現細胞の細胞死は抗酸化剤により阻害された。caspace-3活性の測定を行ったところ、GMF-mProx24ではAlbumin 30mg/ml負荷でcaspace-3活性が著しく上昇し、Wild-type mProx24はコントロールの培養条件と変化を認めなかった。さらにGMF-mProx24でのAlbumin 30mg/ml負荷によるcaspace3活性上昇は、casepace-3阻害剤50μMZ-VAD-fmk、p38阻害剤10μM SB203580の添加により完全に阻害された。GMF強制発現トランスジェニックマウス(GMF-TG)を作成した。同TGマウスは脱毛・脱色など老化現象を示唆する外観を早期から呈する事が明らかとなった。蛋白負荷蛋白尿モデルを導入したがコントロールマウスと有為な差を認めなかった。T細胞の分化・活性化に関わるGPIアンカー型分子TSA-1遺伝子の154-489bpに相当する部分をFLAGとともに組み込んだレトロウイルスベクターpMX-puroを作成した。該pMX-puroをパッケイジング細胞Plat-Eに導入、感染可能なウイルス粒子を得た。ラット腎細胞NRK52Eに感染させ、TSA-1蛋白発現を確認した。CFAをアジュバンドとしてWistar Ratを免疫し免疫7日後、免疫ラットよりリンパ節を摘出、骨髄腫細胞SP2/0を4:1比でポリエチレングリコールを用いて細胞融合する。TSA-1に反応するモノクローナル抗体産生B細胞ハイブリドーマを作製し、培養上清の抗体をFlow cytometryにてスクリーニングした。モノクローナル抗体採取のためスクリーニングを行い候補を得た。
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