| 研究課題/領域番号 |
16590902
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
加納 安彦 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (50252292)
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| 研究分担者 |
村田 善晴 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (80174308)
高岸 芳子 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (50024659)
妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (40135380)
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| キーワード | 甲状腺ホルモン不応症 / 甲状腺ホルモン受容体 / コアクチベーター / 酵母Two-Hybridシステム / cDNA / クローニング |
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| 研究概要 |
甲状腺ホルモン不応症発症の原因となる変異を持つ甲状腺ホルモン受容体(TR)β特異的アクチベーターの同定に向けた第一段階として、酵母Two-Hybridシステムを用いてT_3依存的にTRβに結合するタンパクをコードするcDNAのクローニングを試みた。16年度中の研究により、酵母内でT3依存的にTRβと結合するタンパクをコードするcDNAを26種類クローニングした.17年度はこれらのうち、タンパクの機能が未だ不明な2種類のcDNAに焦点を絞り研究を進めた.
【方法】
1)昨年と同様に、全長ヒトTRβ1cDNAをBaitとして酵母Two-Hybridシステムによりヒト肝臓cDNAライブラリー(AD/cDNAライブラリー、Clonthech社製)を、改めてスクリーニングした。
2)17年度はこれらのうち、タンパクの機能が未だ不明な2種類のcDNAに焦点を絞り(1)全長cDNAのクローニング、(2)Pull-downアッセイのためのベクターの構築を行った。
【結果】
1)さらに20種類のcDNAをクローニングしたが、これらの中には前回のスクリーニングによってクローニングしたものとオーバーラップがあった.
2)(1)全長cDNAのクローニング
クローンNo.60には3種類のmRNAが存在し、演繹されるアミノ酸配列からいずれも核内タンパクであり、DNA結合活性を持つ可能性がある.これら3種類の全長cDNAをクローニングした。クローンNo.93は1種類のみのcDNAをクローニングした.
(2)Pull-downアッセイのためのベクターの構築
クローニングしたcDNAがコードするタンパクが実際にTRと結合するかをin vitroで検討するために、TRをGST融合タンパクとして、クローン60,93のタンパクをHis tagとの融合タンパクとして発現させてpull-downアッセイを行う予定である。本年度はその準備として、各々を大腸菌で発現させるためのベクターを構築した。
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