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造血幹細胞の運命の選択肢には自己複製、分化、アポトーシス等があるが、これを制御する機構についてはよくわかっていなかった。生体内では造血幹細胞は特有なnicheに存在して細胞外の刺激を受けたり、逆に刺激を受けないように保護されていると考えられた。しかし、nicheの場所が特定されていない造血幹細胞の運命決定機構をin vivoで解析するのは難しいと考えられた。そこで、われわれはマウス造血幹細胞を単離し、限定された培養条件下で可溶性蛋白質の直接効果を検討してきた。これまで中胚葉発生に関わる分泌蛋白を含む種々のサイトカインの造血幹細胞の作用を解析してきたが造血幹細胞を分化させないで自己複製を誘導することには成功しなかった。最近、Weissmanらのグループはこれまで困難とされていたWnt蛋白精製に成功し、Wnt3aにはそのような作用があることを報告した。本研究はNusseらの方法に従い各種Wnt蛋白質の精製を試み、これらの造血幹細胞の運命決定におよぼす影響を明らかとすることを目的とした。生物活性を有するWnt蛋白を得るためには脂質修飾(パルミチン酸化)を維持したままの状態で精製することが重要であり、タグを利用したアフィニティーカラムの使用は不可であるとされていた。そこでWnt3aを高発現した細胞株(L cells)の上清からブルーカラムを用いて蛋白精製を数回試みた。Westernブロットで確認できる蛋白質の精製には成功したが、正常造血幹細胞に対してmitogenicな作用は認められず、われわれの精製蛋白ではβ-cateninを介したシグナルを入れることができていないことが免疫染色で確認された。現在、この原因を検討中である。一方、Wnt3、Wnt3a、Wnt5a、Wnt8aのcDNAをレトロウイルス発現ベクターに組み入れ高濃度のウイルスを調整した。これらの遺伝子を導入した造血幹細胞をマウスに移植することによって、これらの蛋白の造血幹細胞機能に対する作用が今後明らかにされるものと期待される。
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