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2004 年度 実績報告書

ELISPOTアッセイによる母児免疫寛容検出法の確立と臨床応用に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号 16590954
研究機関京都府立医科大学

研究代表者

島崎 千尋  京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (50170931)

研究分担者 赤塚 美樹  愛知県がんセンター研究所, 腫瘍免疫学部, 主任研究員 (70333391)
丸屋 悦子  特定非営利活動法人HLA研究所, 主任研究員
キーワード母児免疫寛容 / 母児間マイクロキメリズム / ELISPOTアッセイ / 母児間移植 / 同種造血幹細胞移植
研究概要

1.プラスミドのトランスフォーメーションと増幅
HLA-A11、A0201、A2401、A33-DNA導入プラスミドをコンピテントセルへ導入し、寒天培地で培養後コロニーを採取、LB培地へ移した。培養後増幅した大腸菌よりプラスミドを回収純化した。それぞれのプラスミドの100倍近い増幅に成功し、十分量のプラスミドを得た。
2.プラスミドからHLA-mRNAの作成
HLA-DNA導入プラスミドを制限酵素で切断後、キットを用いてテンプレートDNAの精製とRNAの合成を行った。得られたRNAは電気泳動によって分子量を検定し、さらに純化精製した。HLA-DNAを導入したプラスミドから約1000kbの目的HLA-mRNAを得ることができた。
3.CD40L-NIH3T3によるB細胞の増幅と純化
末梢血液より単核球を分離し、IMDMに浮遊後、IL-4の存在下に放射線照射により不活性化したCD40L-NIH3T3であるfeeder cellと共培養した。約10日間の培養後MACS法による純化を行い、10mlの末梢血液から1.0x10^7程度の活性化B細胞を得ることができた。
4.Electropholation法によるmRNAのB細胞への導入
得られたHLA-mRNAを電気穿孔法を用いて活性化B細胞へ導入した。その後、再度CD40L-NIH3T3とIL-4により刺激した。電気穿孔後のViabilityは75%以上を維持していた。
5.ELISPOT法によるINF-γ産生細胞の同定
末梢血液より単核球を分離し、MACS法でCD8陽性T細胞を純化した。純度は95%以上であった。作成したHLA-mRNA導入B細胞をStimulator、CD8陽性細胞をResponderとし様々な割合で混合して4時間培養後、ELISPOT法によりINF-γ産生細胞の同定を行った。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2004

すべて 雑誌論文 (4件)

  • [雑誌論文] Non-T-cell-depleted HLA-haploidentical stem cell transplantation after reduced-intensity conditioning in advanced hematological malignancies based on feto-maternal microchimerism2004

    • 著者名/発表者名
      Shimazaki C, et al.
    • 雑誌名

      British Journal of Haematology 127・4

      ページ: 474

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] Feasibility of HLA-haploidentical hematopoietic stem-cell transplantation between non-inherited maternal antigen (NIMA)-mismatched family members linked with long-term feto-maternal microchimerism2004

    • 著者名/発表者名
      Ichinohe T, et al.
    • 雑誌名

      Blood 104・12

      ページ: 3821

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] 母児間免疫寛容に基づく同種造血幹細胞移植2004

    • 著者名/発表者名
      島崎千尋
    • 雑誌名

      今日の移植 17・1

      ページ: 51

  • [雑誌論文] 母児間マイクロキメリズムに基づくHLAハプロタイプ一致同種造血幹細胞移植2004

    • 著者名/発表者名
      島崎千尋
    • 雑誌名

      血液・腫瘍科 48・1

      ページ: 115

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公開日: 2006-07-12   更新日: 2016-04-21  

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