| 研究課題/領域番号 |
16590954
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
島崎 千尋 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (50170931)
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| 研究分担者 |
赤塚 美樹 愛知県がんセンター研究所, 腫瘍免疫学部, 主任研究員 (70333391)
丸屋 悦子 特定非営利活動法人HLA研究所, 主任研究員
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| キーワード | 母児免疫寛容 / 母児間マイクロキメリズム / ELISPOTアッセイ / 母児間移植 / 同種造血幹細胞移植 |
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| 研究概要 |
1.プラスミドのトランスフォーメーションと増幅
HLA-A11、A0201、A2401、A33-DNA導入プラスミドをコンピテントセルへ導入し、寒天培地で培養後コロニーを採取、LB培地へ移した。培養後増幅した大腸菌よりプラスミドを回収純化した。それぞれのプラスミドの100倍近い増幅に成功し、十分量のプラスミドを得た。
2.プラスミドからHLA-mRNAの作成
HLA-DNA導入プラスミドを制限酵素で切断後、キットを用いてテンプレートDNAの精製とRNAの合成を行った。得られたRNAは電気泳動によって分子量を検定し、さらに純化精製した。HLA-DNAを導入したプラスミドから約1000kbの目的HLA-mRNAを得ることができた。
3.CD40L-NIH3T3によるB細胞の増幅と純化
末梢血液より単核球を分離し、IMDMに浮遊後、IL-4の存在下に放射線照射により不活性化したCD40L-NIH3T3であるfeeder cellと共培養した。約10日間の培養後MACS法による純化を行い、10mlの末梢血液から1.0x10^7程度の活性化B細胞を得ることができた。
4.Electropholation法によるmRNAのB細胞への導入
得られたHLA-mRNAを電気穿孔法を用いて活性化B細胞へ導入した。その後、再度CD40L-NIH3T3とIL-4により刺激した。電気穿孔後のViabilityは75%以上を維持していた。
5.ELISPOT法によるINF-γ産生細胞の同定
末梢血液より単核球を分離し、MACS法でCD8陽性T細胞を純化した。純度は95%以上であった。作成したHLA-mRNA導入B細胞をStimulator、CD8陽性細胞をResponderとし様々な割合で混合して4時間培養後、ELISPOT法によりINF-γ産生細胞の同定を行った。
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