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申請者はcAMP応答エレメント結合蛋白(CREB)に対するアンチセンスオリゴヌクレトチドが正常造血細胞に影響を与えずに白血病細胞を特異的に殺傷することを見出し(Saeki et al.Leukemia 2001)、白血病治療薬としての有効性につき特許を取得した(特開平11-103860)。さらにアンチセンスCREBの標的は従来報告されていたCREB messageではなくCREB遺伝子に由来する新規なmessageであること、そのmessageはCREB遺伝子のexon 2とintron 4中のAlu elementとがスプライシングを介さない機序により結合していることを明らかにした。しかしこのようなintronとexonの結合したmessageの生成はこれまでの分子生物学の知識では説明できない。そこで当該研究ではこの新規融合型messageの塩基配列を決定するとともにその生成機構を明らかにすること計画した。
平成16年度ではまず塩基配列の決定を試みた。最初にメッセージ末端の塩基配列の決定のために広く行われている方法である3'RACE、5'RACEを行った。これはメッセージの既知の配列に対して作製されたPCR primerと、全てのメッセンジャーRNAの末端に共通に存在する配列を基に作製されたprimerとを用いてPCRを行い、得られたPCR産物の塩基配列からメッセージの塩基配列を決定するものである。PCR反応における条件検討を様々に行ったものの、このメッセージの微量さゆえに特異的PCR産物を検出することはできなかった。そこで別法としてprimer walkingを行った。即ち、nested PCRにより目的のメッセージを検出する際に、1st round PCRのreverse primerだけを順次3'方向へずらしていき当該メッセージが検出されなくなる場所を探すことで3'末端を決定するものである。この方法を用いて融合部から約3000bpに渡ってprimer walkingを行った結果、少なくともpoly A付加シグナル部位はexon 4の3'末端にあるaataaaであることが確認された。
以上より、exon 2にある開始コドンからintron 4にあるpoly A signalまでの3228bpを決定することができた。
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