| 研究課題/領域番号 |
16591194
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
絹谷 清剛 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (20281024)
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| 研究分担者 |
川井 恵一 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (30204663)
鷲山 幸信 金沢大学, 医学系研究科, 助手 (80313675)
吉本 光喜 金沢大学, 医学系研究科, 助手 (00345638)
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| キーワード | 癌 / 放射性医薬品 / 内用療法 / アビジン / スカベンジャー |
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| 研究概要 |
より副作用の少ないアイソトープ内用療法を行うために、ビオチンに高い親和性を有するアビジンとエンドサイトーシス機構により治療核種標識ビオチンの細胞内移行が可能なスカベンジャー受容体を融合したタンパク質(アビジン・スカベンジャー受容体複合タンパク質;スカビジン)の構築を行った。融合タンパク質を構築するためには、それぞれの遺伝子をクローニングしてくる必要がある。まず、ヒトスカベンジャー受容体(hSR-A-II)のクローニングを行った。THP-1細胞(ヒト単球性白血病細胞)に12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetateを負荷し、マクロファージ様に分化させた後に、市販のキットを用い、トータルRNAの抽出を行った。次に、hSR-A-IIを認識するプライマーを用いてPCRによりhSR-A-II cDNAを増幅した。PCR産物のアガロース電気泳動を行い、予想されるバンドを切り出し、精製キットを用いてPCR産物の精製を行った。このPCR産物を用い、StrataClone PCR cloning Kitを使って、hSR-A-II cDNAのクローニングを行った。いくつかのシングルコロニーを選択し、制限酵素処理を行った後にPCR産物の導入の確認を行った。導入が確認されたコロニーに対し、シークエンス反応を行い、hSR-A-II cDNAであることを確認した。アビジンのクローニングは、ニワトリの卵管からトータルRNAを抽出した後、hSR-A-IIのクローニングと同様の方法で行い、シークエンスにより確認を行い、アビジンcDNAを得た。アビジンcDNAをhSR-A-II cDNAと融合させる部位については、hSR-A-IIのエンドサイトーシス機能を保持するために、hSR-A-IIのコラーゲン様ドメインとN結合糖鎖領域の間にアビジンcDNAを導入することを計画した。そのためには、hSR-A-II cDNAの813番目の塩基をチミンからシトシンに変換する必要がある。この点変異によりこの部分のアミン酸が変化することはなく、hSR-A-IIの機能を保持できると考えている。
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