RNAinterferenceによるヒト癌細胞の放射線感受性の増感

2005 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 16591220
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 放射線科学
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 大西 健 奈良県立医科大学, 医学部, 助教授 (50152195)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• キーワード: siRNA / NBS1 / p53 / DNA修復 / 放射線感受性 / 放射線増感 / 癌治療 / sensitization

研究概要

目的
より効率のよい放射線癌治療を行うためには、放射線で誘導されるアポトーシスを積極的に増強させるか、放射線照射後も細胞を生存に導く細胞内反応系を阻害することが有効と考えられる。本研究は後者の考えに基づき、放射線によって生じたDNA損傷の修復系を阻害することにより細胞死を誘導し放射線感受性を高めることを目的とした。放射線によって生じたDNAの2本鎖切断は主に2つの修復系(Homologous recombination, HRとNonhomologous end-joining, NHEJ)によって修復される。HR/NHEJ修復系に関与するNBS1遺伝子の発現をsmall interference RNA(siRNA)によって特異的に阻害することにより、癌細胞を死に導き放射線感受性が高めることができるか、さらにNBS1標的siRNAによる放射線増感に細胞生存シグナル伝達系も関与しているかについて検討した。
方法
p53欠損ヒト非小細胞肺癌H1299細胞に正常型あるいは変異型p53遺伝子を導入した細胞(H1299/wtp53、H1299/mp53)を用いた。NBS1を標的としたsiRNAを発現するDNAカセット(SEC)をX線照射処理の2日前にliposomeで細胞内に導入した。ウエスタンブロッド法と免疫蛍光染色法でNBS1、リン酸化NBS1、Mre11およびRad50蛋白質の量的変化と細胞内局在、免疫沈降法で蛋白質結合様式を検討した。さらに、細胞生存シグナル伝達系ではたらくアポトーシス抑制タンパク質ファミリーの1種であるXIAPタンパク質を阻害するため、XIAP標的siRNAを設計、合成して細胞内に導入した。
結果
1.NBS1標的siRNA導入によって細胞生存シグナル伝達因子であるNF-κBとXIAPの蓄積誘導が阻害された。
2.XIAP標的siRNA導入によりXIAの蓄積誘導が特異的に抑制された。
3.NBS1あるいはXIAP標的siRNA導入によって放射線感受性が増強された。
4.NBS1あるいはXIAP標的siRNA導入による放射線増感率は変異型p53細胞の方が正常型p53細胞よりも高かった。
考察
NBS1あるいはXIAP標的siRNAは難治性の変異型p53細胞の放射線増感に有効であること、DNA修復系および細胞生存シグナル伝達系の阻害によって放射線増感が誘導されることが示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Heat-induced phosphorylation of NBS1 in human skin fibroblast cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., et al.
  • 雑誌名: J.Cell.Biochem. (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] LY294002, an inhibitor of PI-3K, enhances heat sensitivity independently of p53 status in human lung cancer cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., et al.
  • 雑誌名: Int.J.Oncol. (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 変異型p53タンパク質に正常機能を回復させるシャペロン分子 (2006)
  • 著者名/発表者名: 大西健 他
  • 雑誌名: 放射線生物研究 41 ページ: 99-108
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] LY294002, an inhibitor of PI-3K, enhances heat sensitivity independently of p53 status in human lung cancer cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., Yasumoto J.-I., Takahashi A., Ohnishi T.
  • 雑誌名: Int.J.Oncol. (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Apoptosis induced by high-LET radiations is not affected by cellular p53 gene status. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A. et al.
  • 雑誌名: J.Radiat.Biol. 81 ページ: 581-586
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Combination of the antivascular agent ZD6126 with hypoxic cytotoxin treatment, with reference to the effect on quiescent tumor cells and the dependency on p53 status of tumor cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masunaga S, et al.
  • 雑誌名: Oncol.Rep. 14 ページ: 393-400
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Glycerol enhances radiosensitivity in a human oral squamous cell carcinoma cell line (Ca9-22) bearing a mutant p53 gene via Bax-mediated induction of apoptosis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Imai Y., et al.
  • 雑誌名: Oral Oncol. 41 ページ: 631-636
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Glycerol enhances radiosensitivity in a human oral squamous cell carcinoma cell line (Ca9-22) bearing a mutant p53 gene via Bax-mediated induction of apoptosis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Imai Y., Ohnishi K., Yasumoto J.-I., Kajiwara A., Yamakawa N., Takahashi A., Ohnishi T., Kirita T.
  • 雑誌名: Oral Oncology 41 ページ: 631-636
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Combination of the antivascular agent ZD6126 with hypoxic cytotoxin treatment, with reference to the effect on quiescent tumor cells and the dependency on p53 status of rumor cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masunaga S., Nagasawa H., Uto Y., Hori H., Ohnishi K., Takahashi A., Ohnishi T., Suzuki M., Nagata K., Kinashi Y., Ono K.
  • 雑誌名: Oncology Reports 14 ページ: 393-400
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Apoptosis induced by high-LET radiations is not affected by cellular p53 gene status. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A., Matsumoto H., Furusawa Y., Ohnishi K., Ishioka N., Ohnishi T.
  • 雑誌名: International Journal of Radiation Biology 81 ページ: 581-586
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Evidence for the involvement of double-strand breaks in heat-induced cell killing. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A., et al.
  • 雑誌名: Cancer Res. 64 ページ: 8839-8845
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Sensitization by glycerol for CDDP-therapy against human cultured cancer cells and tumors bearing mutated p53 gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yuki K, et al.
  • 雑誌名: Apotosis 9 ページ: 853-859
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Effects of a heat shock protein inhibitor KNK437 on heat sensitivity and heat tolerance in human squamous cell carcinoma cell lines differing in p53 status. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., et al.
  • 雑誌名: Int.J.Radiat.Biol. 80 ページ: 607-614
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] High-LET radiation enhanced apoptosis but not necrosis regardless of p53 status. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A, et al.
  • 雑誌名: Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys. 60 ページ: 591-597
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Effect of mild temperature hyperthermia and p53 status on the size of hypoxic fractions in sold tumors, with reference to the effect in intratumor quiescent cell populations. (2004)
  • 著者名/発表者名: Masunaga S., et al.
  • 雑誌名: Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys. 60 ページ: 570-577
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] C-terminal peptides of p53 molecules enhance radiation-induced apoptosis in human mutant p53 cancer cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., et al.
  • 雑誌名: Apotosis 9 ページ: 597-597
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Glycerol enhances CDDP-induced growth inhibition of thyroid anaplastic carcinoma tumor carrying mp53 gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yuki K., et al.
  • 雑誌名: Oncol.Rep. 11 ページ: 821-824
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Apoptosis-related gene expression after hyperthermia in human tongue squamous cell carcinoma cells harboring wild-type or mutated p53. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yasumoto J., et al.
  • 雑誌名: Cancer Lett. 204 ページ: 41-51
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Radiation-induced apoptosis in SCID mouse spleen after low dose or low dose-rate irradiation. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A., et al.
  • 雑誌名: Int.J.Low Radiat. 1 ページ: 199-207
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Hyperthermic cancer therapy combined with inhibitors targeted against heat-induced signaling factors. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K. et al.
  • 雑誌名: Japan.J.Hyperthermic Oncol. 20 ページ: 143-159
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Radiation-induced apoptosis in SCID mouse spleen after low dose or low dose-rate irradiation. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A., Ohnishi K., Ohnishi T.
  • 雑誌名: International Journal of Low Radiation 1 ページ: 199-207
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Apoptosis-related gene expression after hyperthermia in human tongue squamous cell carcinoma cells harboring wild-type or mutated p53. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yasumoto J., Kirita T., Takahashi A., Ohnishi K., Imai Y., Yuki K., Ohnishi T.
  • 雑誌名: Cancer Letter 204 ページ: 41-51
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Glycerol enhances CDDP-induced growth inhibition of thyroid anaplastic carcinoma tumor carrying mp53 gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yuki K., Takahashi A., Ota I., Ohnishi K., Yasumoto J.-i, Kanata H., Yane K., Hosoi H., Ohnishi T.
  • 雑誌名: Oncology Reports 11 ページ: 821-824
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] C-terminal peptides of p53 molecules enhance radiation-induced apoptosis in human mutant p53 cancer cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., Takahashi A., Inaba H., Yasumoto J., Yuki K., Ohnishi T.
  • 雑誌名: Apotosis 9 ページ: 591-597
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Effect of mild temperature hyperthermia and p53 status on the size of hypoxic fractions in sold tumors, with reference to the effect in intratumor quiescent cell populations. (2004)
  • 著者名/発表者名: Masunaga S., Takahashi A., Ohnishi K., Ohnishi T., Nagata K., Suzuki M., Kinashi Y., Ono K.
  • 雑誌名: International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 60 ページ: 570-577
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] High-LET radiation enhanced apoptosis but not necrosis regardless of p53 status (2004)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A, Matsumoto H, Yuki K, Yasumoto J, Kajihara A, Aoki M, Furusawa Y, Ohnishi K, Ohnishi T.
  • 雑誌名: International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 60 ページ: 591-597
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Effects of a heat shock protein inhibitor KNK437 on heat sensitivity and heat tolerance in human squamous cell carcinoma cell lines differing in p53 status. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., Takahashi A., Yokota S., Ohnishi T.
  • 雑誌名: International Journal of Radiation Biology 80 ページ: 607-614
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Sensitization by glycerol for CDDP-therapy against human cultured cancer cells and tumors bearing mutated p53 gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yuki K., Takahashi A., Ota I., Ohnishi K., Yasumoto J., Yane K., Kanata H., Hosoi H., Ohnishi T.
  • 雑誌名: Apotosis 9 ページ: 853-859
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Evidence for the involvement of double-stand breaks in heat-induced cell killing. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A., Matsumoto H., Nagayama K., Kitano M., Hirose S., Tanaka H., Mori E., Yamakawa N., Yasumoto J., Yuki K., Ohnishi K., Ohnishi T.
  • 雑誌名: Cancer Research 64 ページ: 8839-8845
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] DNA修復関連遺伝子を標的としたRNA干渉によるがん細胞の放射線増感
  • 著者名/発表者名: 大西健 他
  • 雑誌名: 癌の臨床 (印刷中)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Heat-induced phosphorylation of NBS1 in human skin fibroblast cells.
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K., Scuric Z., Yau D., Schiestl R.H., Okamoto N., Takahashi A., Ohnishi T.
  • 雑誌名: J.Cell.Biochem. (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より