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胃癌におけるE2-EPFの発現とその意義の研究を行い、以下の成果を認めた。
1 他の消化器癌でのE2-EPFの発現の検討
食道癌においてE2-EPF mRNAレベルの検討を行った。15検体のmRNAレベルを測定したところE2-EPF発現が食道癌で亢進していることを確認した。
2 胃癌検体の採取
本研究に対し同意の得られた胃癌患者の摘出標本より、癌組織、非癌部胃正常組織を採取し、直ちに-80℃で保存した。また一部は凍結せずTotal RNAを抽出した。
3 抗E2-EPF抗体の作製
E2-EPFの高次構造からエピトープとなり得る領域を選択してペプチド合成を行い、ポリクローナル抗体を作製した。
4 RT-PCR解析
各種胃癌細胞にてE2-EPF mRNAの発現を検討した。すべての細胞株での発現が確認された。
5 イムノブロット解析
各種胃癌培養細胞を抽出後、作製した抗体や本期間中に販売された市販の抗体を用いて各試料のE2-EPF量をイムノブロットにて分析した。Ab4504(abcam)による培養細胞での検討では、E2-EPFの24kDaのバンドの他、48kDaのバンドが認められる細胞株も認められた。またAP2120a(ABGENT)による検討では無数のバンドが認められ、これはE2-EPFが結合したユビキチン化蛋白を認識していると考えられた。
6 免疫組織化学的検討
胃癌摘出標本のパラフィン包埋切片で抗E2-EPF抗体を用いて免疫組織染色を行った。特に核に染色性が強く、細胞内での局在性が認められた。染色強度と臨床病理学的因子、予後の関係は特に認められなかった。
7 siRNAの合成
E2-EPF遺伝子に対し、現在4種のsiRNAのカクテルを作成している。このカクテルを用いて細胞へ導入後24時間でE2-EPF発現レベルが25%以下になるように配列の選定を行った。
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