| 研究概要 |
本年度(平成16年の研究)
細胞採取培養:実験動物としてビーグル犬を用い、腸骨より骨髄を2-3/kg採取後、密度勾配法を用いて単核球成分のみを分離、採取した。続いて採取した細胞をフラスコへ移し,培養液を加えてincubator内にて4週間培養した,単核球成分はフラスコ内において付着細胞へと変化し,内皮細胞,線維芽細胞,平滑筋細胞などのさまざまな血管構成細胞へと分化した.PGA, PCLの共重合体であるP(CL/LA)をスポンジとして用い補強材料を追加したポリマーを用いた.作成する人工血管の内径は3.5mm,全長5cmとした.細胞播種:生体吸収性ポリマーに培養した骨髄間質細胞および浮遊細胞を細胞密度は10^6/cm2を目安に播種した.播種はリアクターチャンバー内にポリマーを装着した状態で行い細菌,ウイルス等のcontaminationを可及的に少なくした.また,播種する前にグラフトをさまざまな物質にて処理を行い細胞接着性の向上を図った.バイオリアクター装着,稼動:バイオリアクターはガス交換器,リアクターチャンバー,リザーバー,拍動流ポンプから構成した.装置全体をCO_2インキュベーター内へ配置し,圧,拍動流,流量,温度等の生理学的条件を調節しながら生体類似環境を作り出し生体吸収性ポリマーに播種した細胞を培養した.拍動流は空気圧圧縮ポンプを応用して作成し,圧リザーバーをおくことにより,生理的な圧波型を作り出す.リアクターチャンバーはマウントした人工血管が回転できるように設計し,細胞が重力の影響を受けて分布に偏りができるのを予防した.また,バイオリアクター稼動中は培養細胞を適宜追加して血管内皮の生育を促進する.培養液はRPMI 1640にGrowth Factor, 10%FBS,抗生物質,heparinを添加したものを用いた.組織の評価:作成された組織に対し,組織学的検討(光顕,電顕,免疫組織学的,DNA量),機械的強度測定(張力試験,破裂試験,コンプライアンス測定),細胞外骨格合成量(collagen, elastin量),機能的検査(薬物負荷試験,血小板凝集能,活性能)を行い自己組織と比較検討する予定である。
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