| 研究概要 |
悪性神経膠腫においてPTEN遺伝子の欠失、EGFR, VEGFR遺伝子の増幅が報告されていることから神経膠腫手術標本においてAkt/PKBの活性化を評価した。Akt/PKBはリン酸化されることにより活性化されるので、その評価にはリン酸化Akt/PKBに対する特異的抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、神経膠芽腫では非腫瘍組織に比較して、リン酸化Akt/PKBの発現が上昇しており、Akt/PKBが活性化されていることが示された。また、PML (promyerocytic leukemia)の発現を神経膠芽腫手術摘出標本において抗PML抗体を用いた免疫染色を行い評価したところ、その発現の低下を認めた。PML遺伝子の発現について、神経膠芽腫手術摘出標本からmRNAを抽出し、cDNAを合成した後に定量的PCRを行い検討した.その結果、非腫瘍組織に比較し、腫瘍ではPML遺伝子の発現が低下していた。
これらの所見をもとにヒト神経膠腫培養細胞にて、Akt/PKB, PMLの腫瘍生物学的重要性を検討した。
Akt/PKBをRNA interfrenceの手法を用いて、Akt/PKBに対するshRNA(Akt-shRNA)をヒト神経膠腫培養細胞に導入した。ウエスタンブロッティングにてAkt/PKBのタンパク発現レベルの低下を確認した.細胞増殖について、細胞数をカウントして検討した。コントロールshRNAを導入した細胞に比較し、Akt-shRNAを導入した細胞では、放射線照射後の細胞増殖が抑制された。また、エタノールでDNA断片を抽出後、ヨウ化プロピジウム(PI : propidium iodide)にて染色し、フローサイトメトリーを行った。放射線照射後のアポトーシスの誘導をフローサイトメトリーのsub G1 populationの割合で評価した。
Akt-shRNA導入細胞では、コントロールと比較して、sub G1 populationの増加を認めた。神経膠腫細胞においてAkt/PKBが抗アポトーシスに働いていることが示唆された。
また、PMLタンパク、PML遺伝子の発現を免疫染色、定量的PCRを用いて、複数の神経膠腫細胞間でその発現を評価した。PMLの発現が低い細胞では、細胞増殖能が高いという結果が得られた.
現在、Akt/PKB、PMLの役割をさらに詳細に調べている。
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