| 研究課題/領域番号 |
16591461
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
脳神経外科学
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
松野 彰 帝京大学, 医学部, 教授 (00242058)
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| 研究分担者 |
長島 正 帝京大学, 医学部, 教授 (70217991)
藤巻 高光 帝京大学, 医学部, 助教授 (80251255)
中込 忠好 帝京大学, 医学部, 教授 (90198052)
竹腰 進 東海大学, 医学部, 助教授 (70216878)
長村 義之 東海大学, 医学部, 教授 (10100992)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| キーワード | 成長ホルモン / 下垂体細胞 / 分泌顆粒 / GFP / chromogranin A / secretogranin 3 / carboxypeptidase E / phogrin |
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| 研究概要 |
本研究では、生細胞(ラット下垂体培養細胞、GH3 cell)において、green fluorescent protein(GFP)を用いて、GHの分泌顆粒の細胞内輸送と分泌を可視化することを目的とした。また、Rab3Bがどのように関与しているか、また分泌顆粒形成に関わる分子についても、検討した。
ラットGHのcDNAは既にATTCより入手済みであった。ラットrab3BのcDNAをラット下垂体組織よりmRNAを抽出し、RT-PCRにより作製した。GHとrab3BのそれぞれのcDNAに対して制限酵素サイトをPCRに付加し組換えを行い、2種類のgreen fluorescent protein(GFP)、すなわち、GHにはYFPを、rab3BにはCFPを融合させた。GH-YFPとrab3Bの組換え遺伝子を、ラット下垂体細胞株であるGH3細胞に導入した。トランスフェクションは、lipofectamineを用いて行った。GH-YFPを発現する細胞については、stable cell lineを確立した。その発現を生細胞内で共焦点レーザー顕微鏡下に観察し、確認した。細胞外Kを高濃度にし、Caイオンの流入をおこさせ、GHの分泌をおこさせた。このstable cell lineに対して、rab3B-CFPを一過性にトランスフェクションした。現在、GHの分泌顆粒の細胞内輸送の過程でrab3Bが関与していることを確認した。Regulatory pathwayとconstitutive pathwayの両方において、rab3Bの役割を確認した。
chromogranin A、secretogranin 3, carboxypeptidase E, phogrinについても同様の実験を行い、GH分泌顆粒形成過程で、これらのいずれの蛋白もが関与していることを明らかにした。
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