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本年度は筋細胞に対して導入効率の高いプラスミド構築、徐放性ポリマーを用いたin vivoにおける遺伝子導入と導入効率の高率化に取り組んだ。
発現ベクターに筋細胞で発現が強いとされている哺乳類細胞発現ベクターpCAGGSにマーカー遺伝子であるLacZを挿入、プラスミド構築した。
我々はin vitro実験で、未分化間葉系細胞への遺伝子導入にはカチオン性脂質であるLipofectoamine 2000が効果的であることを検証しており、今回さらなるin vivoでの遺伝子導入効率の高率化を求めて徐放性ポリマー(PLA-PEG)とプラスミドDNAにLipofectoamine 2000を加えて検討した。
マウスの背筋筋内に(1)45mgの徐放性ポリマー(PLA-PEG)にDNA45μgを含有させたペレット(2)45mgのポリマーにDNA45ugとLipofectoamine 2000 15μlを含有させたペレット(3)ポジティブコントロールとして背筋筋内にDNA45μgを注入直後にエレクトロポレーション処理(4)ネガティブコントロールとしてポリマーにPBS30μlを含有させたペレットを埋植した。
遺伝子導入の定性的評価にpCAGGS-LacZを、定量的評価にGL3-Luc用いた。埋植後1週間で屠殺、固定後にX-gal染色を行った。ネガティブコントロールではX-gal染色で陰性であったが、ポジティブコントロールに比べると弱いもののDNA + lipofection 2000群でより強い染色性が認められた。ルシフェラーゼアッセイではDNA + lipofection2000群でより多くの発現が見られたが、ポジティブコントロールに比べると少なかった。
今後はさらなる導入効率の高率化とサイトカインとの併用療法を目指し、ポリマーの種類、カチオン性脂質の選定、DNAとカチオン性脂質の配合比などを検討していく予定である。
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