| 研究概要 |
ヒトカリクレイン(Human KLK)4,5,6,9,10,11について,臨床検体間における遺伝子発現量比較のためにABI PRISM 7700 Sequence Detector(ABI)を利用したTaqMan Probe Real-time RT-PCR法を行う準備を進めた.
まず,Primer Express ver 1.5(ABI)ソフトウェアを用いてHuman KLK 4,5,6,9,10,11のopen reading frame内においてReal-time RT-PCR用プライマーおよびTaqMan Probeをデザインした.これらのプライマーを用い,卵巣癌細胞株3種(OVISE, OVTOKO, MCAS)から得られたcDNAを鋳型として通常のPCRを行った後,PCR産物をサブクローニング,塩基配列を解析したところ,デザインした全てのプライマーが標的cDNAを特異的に増幅することが確認された.
さらに上記の過程で得られたPCR産物をサブクローニングしたベクタープラスミドを標準コントロール検体に利用して,標準曲線法でReal-time PCRを行うこととした.内因コントロールには18sを標的遺伝子とし,ABI社から提供されているTaqMan Real-time PCR TaqMan Ribosomal RNA Control Reagentsを使用した.
提供者の同意の下,手術検体より得られた卵巣癌組織34検体は,近接組織HE標本を顕微鏡下に観察し,癌組織が組織の大半を占めていることを確認した.各々の組織よりQIAGEN Rneasy KiRNA抽出し,oligo-dT primerを用いてcomplementary DNAを作製,β-actin発現を通常PCRで確認し,RNAの変性が最小限であることを確認した.現在,Real-time PCR法にて各サブタイプの遺伝子発現量の定量を進めている.
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