| 研究課題/領域番号 |
16591757
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
眼科学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
園田 康平 九州大学, 大学院・医学研究院, 助手 (10294943)
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| 研究分担者 |
吉田 裕樹 佐賀大学, 医学部・分子生命科学講座, 教授 (40260715)
江頭 健輔 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (60260379)
畑 快右 九州大学, 大学院・医学研究院, 講師 (90346776)
吉田 茂生 九州大学, 大学院・医学研究院, 助手 (50363370)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| キーワード | 角膜移植 / NKT細胞 / サイトカイン / トレランス / DNAマイクロアレー / 遺伝子導入 / 免疫療法 |
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| 研究概要 |
マウス角膜移植モデルでの解析
移植後7日目にNKT細胞を脾臓および末梢血から分離し、その産生するサイトカイン・ケモカインを解析した。マウスNKT細胞は抗NK1.1抗体を用いた磁気細胞分離システムで分離した。NKT細胞はIL-2及びIL-15存在下に、NKT細胞のリガンドであるαGalCerを加え、細胞を常時刺激した。安定して4週間ほど培養できるようになった。NKT細胞内タンパク染色&フローサイトメトリー,RNAse protection assayで細胞産生サイトカイン・ケモカインのスクリーニングをおこなった。IL-10をいずれの方法でもNKT細胞が産生することが確認できた。
NKT細胞の培養
ヒトCD1d拘束性NKT細胞を磁気細胞分離システムを用いて分離した。正常人でのコントロール実験では約90%の精製率でNKT細胞を純化できた。マウスでの予備実験と同様にIL-2及びIL-15存在下に、NKT細胞のリガンドであるαGalCerを加え、細胞を常時刺激した。マウスとの大きな違いは、加えるウシ血清で増殖が異なり、選定に時間を要したことである。安定して2週間ほど培養できるようになった。
NKT細胞産生サイトカイン・ケモカインのスクリーニング
インフォームドコンセントを得た上で、角膜移植後患者のNKT細胞サイトカイン産生パターンを正常人のものと比較解析した。角膜移植後、長期生着している患者のNKT細胞はいずれの方法でもIL-10を産生することが確認できた。正常人と比較して、長期生着移植患者では、IFNγ,TNFα,RANTESの産生が低下していた。しかし測定値の定量が難しく、また同一人でも時期により産生能が変化した。
NKT細胞の改変
サンプル数の関係で、今回は正常人のNKT細胞にIL-10を導入した。導入は成功し、遺伝子発現をRNAse protection assayで確認した。成長因子の濃度や種類を変えるなどの工夫を行ったが、前述の培養期間の限界があり、導入細胞の2週間以上の長期安定増殖には至っていない。
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