| 研究概要 |
1)EGF family、抗菌ペプチドの作成およびその抗体の作成
EGF familyであるEGF、TGF-α、amphiregulin、epiregulin、HB-EGFおよび抗菌ペプチドであるhuman beta-defensin 1,2,3,4およびCAP18を大量作成、各々に対しポリクロナル抗体を作成した。
2)角化細胞の自然免疫機構の解明
(1)EGF familyによる抗菌ペプチド産生誘導
作成したEGF familyを培養細胞に添加し、抗菌ペプチドの発現をRT-PCR、real-time PCRにてmRNAを検討し、遺伝子レベルで確認した。
(2)細菌による刺激
各培養細胞に黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、大腸菌、ざそう桿菌などを加え、抗菌ペプチド、サイトカイン、ケモカインなどどの遺伝子が誘導されるかをreal-time PCRで確認した。
(3)TLRの特異的なリガンドによるによる刺激
各培養細胞をペプチドグリカン、poly(I:C)、LPS、imidazoquinoline、CpG DNAで刺激し、同様に発現遺伝子を検索した。
3)創傷モデルの作成および抗菌ペプチドの発現の観察
(1)マウス背部に直径8mm大の皮下組織に達する創傷を作成後6hr、12hr、24hr、2日、3日、4日、7日に創部を生検、半切しホルマリン固定と凍結固定とした。標本薄切後、ホルマリン標本はH-E染色で、凍結標本は抗マウスβデフェンシン(anti-mBD)-1、2、4、6および抗CRAMP抗体による免疫組織化学で検討。
(2)mBD-1およびmBD-4は創傷作成後6hrから2日後まで創傷周囲の真皮に発現。CRAMPは創傷作成後6hrから4日目まで創傷周囲真皮および辺縁表皮に発現。mBD-6は創傷周辺の表皮および毛包に6hrから3日目まで発現。mBD-2は創傷周辺の真皮、表皮、毛包全体に発現し、3日目まで持続。
(3)マウスの抗菌ペプチドのうちmBD-2は創傷発生後周辺組織全体に発現するが、その他は創傷のごく周辺の真皮あるいは毛包を含む表皮のみに発現していると考えられた。発現期間は創傷発生直後からおおむね2日ないし4日までの間であると考えた。
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