| 研究概要 |
原核生物のプロテオーム解析をマイクロアレイで行なう場合には通常、約10μgの全RNAが必要とされるが、臨床サンプルから得られるRNAは極微量であるためその量を確保する事は困難である。本研究は微量RNAを増幅する目的で、T7配列付加のランダムプライマー(T7-N6)を使用し、ngオーダーの微量RNAをin vitro transcription(IVT)法にて増幅することでアレイ解析が遂行可能かを検証した。基本的には真核生物用GeneChipマニュアルに従って、0.05および0.5μgのE.coli全RNA試料からIVT法にて1回増幅または2回増幅を行ない、E.coli Genome2.0 Array(Affymetrix社)にて解析した。またRNA増幅を施さない方法は原核生物用GeneChipマニュアルに準じて行なった。T7-N6を使用してRNAを1回IVT増幅した結果と2回IVT増幅を行なった結果との相関係数は0.87(Parametric, two-tail, p<0.01)であり、増幅をしない試料から得られる結果と1回IVT増幅した結果との相関係数は0.75、2回IVT増幅した結果との相関係数は0.69(共にParametric, two-tail, p<0.01)となり統計学的に有意に高い相関が認められた。またcDNAをbiotin末端標識するGeneChipマニュアル法に比較してIVT法によってUTP-およびCTP-biotinを取り込ませる方法で得られた試料の方が、各遺伝子のraw signal値の平均はおよそ4倍高い値が得られた。これらの結果から原核生物のプロテオーム解析にT7-N6を使用する事は非常に有用であることが確認された。
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