| 研究概要 |
我々はN6-T7プライマーを用いて、経済的で効果的なリニア増幅を導く原核生物用のRNA増幅法を開発した。Affymetrix社のGeneChipマイクロアレイプロトコールに従って、全RNAから得られたcDNAを用いたRNA増幅しない試料、および、500ngまたは50ngの全RNAを1回IVT(In vitro transcription)法または2回IVT法で増幅した試料とで、得られたマイクロアレイ結果の再現性を検討した。我々のN6-T7プライマーを用いたプロトコールでは、コンスタントにマイクロアレイ実験に必要なマイクログラムオーダーのRNA増幅が可能であった。またN6-T7プライマーを用いて得られた増幅試料で得られた結果は、増幅しないで得られた結果と高い相関が得られた。
IVT法によるリニアRNA増幅は真核生物に用いられるスタンダードな技術である。加えて、ランダムプライマーは原核生物の遺伝子発現解析によく用いられる。従って、本プライマーを使用する事の優位性・利便性は以下の通りである。1)プライマーの製造が容易かつ安価である。2)必要な試薬類の大部分は真核生物用IVTキット中に含まれる。3)マイクロアレイのプローブ作製法(オリゴプローブやPCRプローブ他)や標識法-一色法(ビオチン標識やCy5標識他)や二色法(Cy3とCy5)にとらわれない。4)目的に応じてsense鎖の増幅、antisense鎖の増幅、またはsense, antisense鎖の両方とも増幅可能である。5)Gene Chip標準マニュアル法の3'末端標識に比較してIVTではバックグランド蛍光強度は変化しないが、目的遺伝子の蛍光強度が強まるため、S/N比が高まることから、10wcopy数の遺伝子に対してより精度の高い解析が行なえる。
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