量子ドットを用いたシナプス間隙における膜蛋白質動態解析

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16650075
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 岡部 繁男 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60204012)
• キーワード: 蛍光顕微鏡法 / 一分子イメージング / グルタミン酸受容体 / シナプス

研究概要

ストレプトアビジン結合量子ドットを利用して、ビオチン標識した細胞膜表面抗原に対する抗体による生細胞の染色を行う事で、生きた神経細胞の表面での膜蛋白質の動態を追跡した。初代培養海馬神経細胞に組み換えアデノウィルスを用いてペプチドタグの付加されたNMDA受容体を発現させ、量子ドットを利用して膜表面でのNMDA受容体の検出を行った。蛍光シグナルは海馬神経細胞の樹状突起に観察されたので、更に量子ドットの分布をシナプス前部および後部構造のマーカーであるsynapsin I、PSD-95の抗体染色像と比較した。量子ドット由来のシグナルは、シナプス前部および後部構造のマーカーと一部重なって観察されたが、シナプス外領域に存在する量子ドットのシグナルがシナプス内に存在するシグナルより総和としては大きくなった。この結果は内在性のNMDA受容体全体の分布とは異なっており、可能性として細胞膜表面でのNMDA受容体の局在はシナプス部位よりもシナプス外領域に優位である事が考えられた。内在性のNMDA受容体を染色する抗体では細胞表面の分子を選択的にラベルする事が不可能であったので、細胞外ドメインにmycタグの付加されたNR1サブユニットについて、量子ドットとAlexa色素による染色パターンを比較した。両者の染色パターンは良く一致しており、利用した蛍光タグの相違で内在性の蛋白質との分布の違いが生じたのではない事が分かった。しかしながら量子ドット一分子の蛍光シグナルの細胞膜上での動態は、Alexa一分子の動きに比較して遅く、量子ドットを利用した場合には膜上受容体のクラスタリングが引き起こされている可能性が示唆された。量子ドットに対する抗体の結合比率を検討する事で、クラスタリングが引き起こされない実験条件を選択する事が必要である事がわかった。

研究成果

• [雑誌論文] Bi-directional regulation of postsynaptic cortactin distribution by BDNF and NMDA receptor activity (2005)
  • 著者名/発表者名: Iki, J., Inoue, A., Bito, H., S.Okabe
  • 雑誌名: European Journal of Neuroscience 22 ページ: 2985-2994
• [雑誌論文] Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., S.Okabe
  • 雑誌名: Nature Methods 2 ページ: 677-684
• [雑誌論文] The RNA-binding protein TLS is translocated to dendritic spines by mGluR5 activation and regulates spine morphology. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujii, R.^*, Okabe, S.^*, Urushido, T., Inoue, K., Yoshimura, A., Tachibana, T., Nishikawa, T., Hick, G.G., T.Takumi, ^*equal contribution
  • 雑誌名: Current Biology 15 ページ: 587-593
• [雑誌論文] High-purity lineage selection of embryonic stem cell-derived neurons. (2005)
  • 著者名/発表者名: Schmandt, T., Meents, E., Gossrau, G., Gornik, V., Okabe, S., O.Brustle
  • 雑誌名: Stem Cells and Development 14 ページ: 55-64
• [雑誌論文] Direct visualization of cell movement in the embryonic olfactory bulb using green fluorescent protein transgenic mice : evidence for rapid tangential migration of neural cell precursors. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, K., Yamaguchi, M., S.Okabe
  • 雑誌名: Neuroscience Research 51 ページ: 199-214
• [雑誌論文] Simultaneous observation of stably associated presynaptic varicosities and postsynaptic spines : morphological alterations of CA3-CA1 synapses in hippocampal slice cultures. (2005)
  • 著者名/発表者名: Umeda, T., Ebihara, T., S.Okabe
  • 雑誌名: Molecular and Cellular Neuroscience 28 ページ: 264-274
• [雑誌論文] Telencephalin slows spine maturation.
  • 著者名/発表者名: Matsuno, H., Okabe, S., Mishina, M., Yanagida, T., Mori, K., Y.Yoshihara
  • 雑誌名: Journal of Neuroscience in press