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ES細胞に未発現のターゲット遺伝子のへshRNAの導入の第1段階としてハイグロマイシン耐性フィーダーを用いて、ターゲットの直鎖状化したHAタグ遺伝子を融合させた未発現遺伝子であるG93ASOD1変異遺伝子を発現ベクターに組み込み、これをエレクトロポレーションした。ハイグロマイシンで耐性ES細胞を選択して、50個の耐性ES細胞クローンの中からHAタグでウエスタンブロットを行いターゲット遺伝子を安定を発現したES細胞クローンが得られた。
第2段階として未発現遺伝子が安定発現したES細胞ラインに対して、直鎖状化したShort-hairpinタイプのsiRNA発現ベクターをエレクトロポレーションしてネオマイシンでshRNAを安定発現ES細胞をクローン化した。HAタグタグでウエスタンブロットを行いターゲットG93ASOD1遺伝子発現が抑制されているG93ASOD1変異遺伝子とshRNAの両者が安定発現し、第1段階で発現させたG93ASOD1を有効に抑制しているES細胞クローンが作製できた。
現在このダブル遺伝子安定発現ES細胞クローンをブラストシストにマイクロインジェクションしてキメラマウスを複数のクローンで作製したが、ESの寄与率が悪く、トラブルシュートとして第1段階のES細胞クローンでキメラマウスを作製中である。
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