| 研究概要 |
本年度は、海洋細菌の分離培養株[α-proteobacteria 2株(Erythrobacter, Sulfitobacter)、γ-proteobacteria 4株(Halomonas, Psudoalteromonas, Vibrio, Vibrio)、CFB group 3株(Cytophaga, Cytophaga, Bacteroidetes)]を用いて、特異的かつ同時的な検出が可能となる方法と条件についてプロトコールの検討を行った。
■検出用蛍光ビーズの調整:16SrRNAをターゲットとした5種類の検出用DNAプローブ(EVB338、NON338、ALF968、CF319、GV)を作成し、それぞれ異なる蛍光ビーズに、カルボジイミドカップリング法によって結合した。
■サンプルDNAの調整:培養した細菌細胞からDNAを抽出し、16S rDNAの全長(1500bp)もしくは部分断片(500bp)を、ビオチン化プライマーもしくはビオチン化dNTPによって標識しながら増幅した後、PCR産物をさらにストレプトアビジンフィコエリスリンによって蛍光標識した。
■ハイブリダイゼーション:バッファー、温度、反応時間の検討を行い、TMACバッファーを用いて42℃もしくは36℃で反応、15〜20分で比較的良好な結果を得た。特に、CFB groupに特異的なCF319プローブは、高いS/N比を与え、サンプルDNA量と蛍光シグナルの間に高い相関が得られたことから、環境試料での定量が可能であると考えられる。その他のプローブ(EVB338、ALF968、GV)でも検出は可能であったが、S/N比が低く、さらに検討が必要である。特に、1500bpの長い断片のハイブリダイゼーションが弱いことは、多種類のプローブをデザインする上での制約となることから、反応系の見直しによって改善する必要がある。
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