| 研究概要 |
昨年度までの研究で確立した、生物発光特性の電子移動による制御(Bioluminescent enzyme-induced electron transfer;以下BioLeTと略す)に基づくプローブ設計に必須となる、発光On/Offの境界電子密度を正確に決定するため、様々な電子密度を有する芳香環を持つパイロット化合物を合成し、その発光特性を精査した。その結果、アミノルシフェリン発光中間体に対する電子移動はアニソール程度の芳香族化合物でも起こりうる一方、発光中間体を電子供与体とするd-BioLeTはニトロベンゼン程度の電子受容能では起こりえないことが明らかとなり、a-BioLeTによるプローブ化に適した骨格であることが明らかとなった。次にアミノルシフェリンと通常のルシフェリンの発光波長が40-50nm程度異なることを利用し、ウェスタンブロットの2次抗体用の酵素として汎用される、HRPとALPの同時定量を試みた。具体的にはHRP/過酸化水素系の発光プローブとして昨年度までに開発に成功したAPLを、ALPのプローブとしては市販のリン酸化ルシフェリンを用い、両者の混在する発光からスペクトル分析で2種の発光を分離することを試みた。具体的には両酵素を任意の割合で混合し、ここに2種のプローブを添加した後、ルシフェリン、ATPを加え、2種の発光スペクトルの分離定量を試みた。その結果、545nmと615nmのフィルターを用いて得られる発光強度を、基準スペクトルパターンに基づいて解析することで両者の分離が可能であり、実際HRP, ALPの活性を同時に検出・定量出来ることが示された。本結果は、ウェスタンブロット膜上における2種以上のタンパクの定量を、同時に信頼性高く行うことを可能にするものであり、分析手法としての生物発光法の幅を広げる画期的なものである。
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