| 研究概要 |
本研究の目的は,原形質膜外、すなわち、アポプラストへ分泌された後のタンパク質の選別・回収の分子機構の存在を実証し,その分子機構の解明に繋がる糸口をつかむことである。この目的のために,まず、分泌タンパク質の中より明確な発現・分泌制御が行われ,また,細胞壁中の残留期間の短い機能タンパク質(ターゲットタンパク質)の特定を進め、その分泌タンパク質が細胞壁中で安定化される仕組み(安定化のための修飾機構)と,その安定化を解除し,細胞内への回収過程を作動させる仕組み(安定化解除および回収指令機構)の解明を進めている。
細胞壁中に分泌されるタンパク質を特定するために、シロイヌナズナの培養細胞Alex株を用いて、細胞中に存在するタンパク質および細胞壁再生中のプロトプラストの細胞壁中に分泌されるタンパク質のそれぞれのサブプロテオーム解析を行った。細胞壁サブプロテオームを行うに当たっては、細胞を破砕せずに、無傷の培養細およびプロトプラストより1時間および3時間細胞壁を再生を経たのちの細胞より、それぞれIMKCl溶液により細胞壁にイオン結合により吸着しているタンパク質を溶出させた。この方法を用いることにより、原形質や液胞タンパク質の混入のない細胞壁タンパク質画分を得ることが可能となった。上記の三つの細胞壁画分由来のタンパク質を二次元電気泳動により分離・マッピングを行ったのち、それぞれのタンパク質スポットを回収し、トリプシン消化後、MALDI-TOF/MSにより一次構造推定および遺伝子の推定を行った。更に、各タンパク質スポットのリン酸化および糖鎖付加の状態を解析した。その結果、細胞壁再生過程で著しい変動を示す、タンパク質群を同定することができた。
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